Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

помощью (15) и (11) переписать в виде

AV* = Vx* — (VE + Vs). (19)

Таким образом, произведя две ^ерии опытов под давлением-, мы получаем возможность найти AV* и AV— парциальный объ-

164

ем реакции образования комплекса ES (см. формулу (11)). Если из независимых измерений (например, денситометрических [13]) определен парциальный объем фермента VE, то, пренебрегая обычно сравнительно малым парциальным мольным объемом субстрата, из (19) можно вычислить парциальный мольный объем активированного промежуточного состояния Xf стадии диссоциации комплекса ES: ,

Vx# s V? + AV\ (20)

2. Случай, когда k^k-\. При этом вместо (8) имеем

у_ ki^h [Е] [S] . (21)

а) если к\ [S] > k2, то

v = kz[E] = k2.0 [Е]«ГРД^/КТ, что в точности совпадает с результатом, полученным в случае 1а.

б) если k\ [S] то

fl=ME][S], (22)

где в соответствии с (5)

k^k^e-^™. (23)

Здесь AVf есть приращение суммы парциальных мольных объемов фермента и субстрата при образовании активированного комплекса процесса E + S->-(ES)^ [4].

Из всего изложенного можно заключить, что исследование ферментативной кинетики под гидростатическим давлением позволяет определить либо изменения парциальных мольных объемов исходных реагентов при образовании активированных комплексов, либо — в благоприятном случае k?<^.k-\ — найти величину парциального мольного объема активированного комплекса Xf.

Надо, однако, иметь в виду, что величина парциального объема не совпадает с физическим объемом макромолекулы. Действительно, определение парциального удельного объема v гласит [14], что это есть увеличение объема при добавлении 1 г сухого белка к очень большому объему раствора. Размерность и — см3/г. Парциальный мольный объем (см3/моль) получается умножением v на молекулярный вес (массу) белка М.

¦ Из этого определения видно, что величина парциального объема, а следовательно, и АУФ, отражает не только изменение физического объема белковой молекулы, но и ее воздействие на окружающую воду — воздействие, которое называют гидратацией и которое все еще остается плохо изученным, несмотря на громад-

165

Оценка изменений в при различных химических и физических реакциях (при 1 атм) (17)

Реакция —»* Вклад в AV , см'/моль

+ 10

. ~о

—10

-5

Компенсация диффузии . . . >+20

^,0

—20

Стерические ограничения . . (-)

+20

Рассредоточение зарядов . . +5

Концентрация зарядов . . . —5

ное число посвященных ему исследований (см., например, обзоры [15, 16]).

Физическая сущность гидратации состоит, по-видимому, главным образом ,в небольшом торможении теплового движения молекул воды в непосредственной близости от заряженных и полярных групп белка [16]. И хотя эту воду нельзя считать иммобилизованной, все же ее асимметричные дипольные молекулы ориентируются в этих местах «специфической гидратации» ие столь беспорядочно, как в свободной воде, благодаря чему уменьшается занимаемый ими объем. Поэтому перезарядка боковых групп в белке, в частности при взаимодействии с лигандами, обязательно сопровождается изменениями гидратации и соответственно парциального мольного объема.

Согласно формуле (5), если ЬУ^ФО, то давление будет либо замедлять скорость реакции (при AV:#>0), либо увеличивать ее (при AV4fc<0). Ориентировочное представление о том, какого порядка вклад могут вносить в изменение парциального мольного объема активации различные химические и физические реакции, дает таблица, составленная по данным о низкомолекулярных соединениях [17].

Для сравнения укажем, что при инактивации митохондриальной АТФазы в процессе гидролиза АТФ AV='fc=184 см3/моль [18].

Интересное наблюдение было сделано Пеннистоном [19]. Ис-хледовав большое число ферментов, он пришел к заключению, что в случае мономерных ферментов AV=#<0, т. е. давление активирует их, в_то время как для мультисубъединичных ферментов, наоборот, ДУ^>0, и под давлением они инактивируются. Пример с АТФазой укладывается в эту схему, но тем не менее заключение Пеннистона нельзя рассматривать как общую закономерность [2, 10]. К тому же, как отмечалось и в [19], инактивация мультимерных ферментов под давлением полностью или частично вызывается их диссоциацией на субъединицы. В таком случае по формулам (2) или (5) уже нельзя определить активационный объем, так как на скорость реакции оказывают воздействие не .только изменения в активном центре, но и на межсубъединичных участках.

Формально это вытекает из следующих простых рассуждений. В общем случае мультисубъединичного фермента, состоящего

166

из п ковалентно не связанных между собой субъединиц Et т типов, константу ассоциации и ее зависимость от давления можно записать в виде t

К = -т-Е!-- К^Р^Т. (24)

П rEi

где Е — интактный активный фермент, v,- — число субъединиц i-того типа (t=l, 2, т), AVS — парциальный мольный объем реакции ассоциации субъединиц. Обозначив парциальный мольный объем свободных субъединиц V,-, имеем

AVS = VE-? v,V,. (25)

Когда изолированные субъединицы Е,- не обладают каталитической активностью, уравнение скорости ферментативной реакции у=&[Е] с учетом (5) и (24) принимает вид

, „ А ггг IV- -P(uv!lA vs)/rt i

Отмеченная Пеннистоном [19] часто встречающаяся инактивация давлением мультимерных ферментов в рамках (26) означает, что (AV^+AVs) >0. Могут встречаться разные типы и размеры приращения активационного объема и объема реакции ассоциации, но распространенной ситуацией является, по-видимому, большое и положительное значение AVS. Это означает в соответ-

т

ствии с (25), что J]v?Vjединицы выходят в раствор, их парциальный мольный объем уменьшается. Это может происходить из-за гидратации межсубъ-единичных участков, вступающих в контакт с водой, и, в частности, из-за заполнения водой пустот, которые иногда существуют в этих местах в интактной мультимерной макромолекуле [20].

Таким образом, опыты под давлением не дают однозначной информации об оъемных эффектах в мультисубъединичных ферментах.

Однако важной особенностью исследований ряда ферментов под давлением является обратимость реакции диссоциации — ассоциации и сопряженной с ней инактивацией — реактивацией [21]. Поскольку обратная ассоциация субъединиц в нативный фермент в тех случаях, когда она возможна, требует некоторого времени, главным критерием того, что_опыты под давлением дают истинные активационные объемы AV^, должна быть быстрая обратимость действия давления на скорость реакции. Действительно, если единственной причиной изменения скорости является

167

непосредственное воздействие давления на стадию образования активированного комплекса, то согласно формулам (4) и (5) снятие давления должно приводить к очень быстрому восстановлению исходной активности фермента.

Морилд [10] подробно разобрал важный частный случай исследования фермента, состоящего из двух субъединиц.

Техника эксперимента

Устройства для изучения влияния гидростатического давления на ферменты различаются в зависимости от цели исследований, избранно

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2019)