Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

фии, однако получаемые оли-томеры утрачивают способность к взаимным переходам. Послед-" .нее обстоятельство позволило определить удельную активность .каждого из выделяемых в электрофоретически гомогенном состоянии олигомеров и показать, что олигомеры разной степени ассоциации проявляют различную каталитическую активность.

Определяя в растворе активность того или иного фермента, обладающего четвертичной структурой, экспериментатор часто не имеет возможности составить представление о том, как изменяется и меняется ли вообще эта структура в процессе каталитического акта. Такой вопрос просто не возникает, если кинетическое поведение ферментов не обнаруживает отклонений от простых кинетических закономеростей типа гиперболического закона Михаэлиса—Ментен.

Отсутствие зависимости а от [Е]5 для гомогенных препаратов НАД-киназы из печени кролика исключало возможность кооперативных эффектов, опосредованных смещением равновесия между олигомерами разной степени сложности. Между тем исследование гомогенных а- и р-форм фермента методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы в условиях протекания ферментативной реакции обнаружило молекулярную гетерогенность таких препаратов и позволило установить ряд интересных закономерностей.

Четвертичная структура НАД-киназы в условиях протекания ферментативной реакции

В том случае, когда диссоциирующий фермент представлен равновесной системой нескольких олигомеров, определение активности фермента при насыщающих концентрациях субстратов не может дать представления о том, какие из этих форм каталитически активны. Положение еще больше усложняется, когда олигомеры различаются по каталитической активности. <

Использование метода ультрацентрифугирования (УЦ) в присутствии субстратов ферментативной реакции, с одной стороны, позволяет решить вопрос о вкладе каждого из олигомеров в общую активность фермента, с другой — определить молекулярный вес нативного фермента, а также число и Мг «активно работающих» форм. Этот метод имеет еще и то преимущество, что позволяет использовать малое количество фермента — всего 1 мкг

153

[32]. Несмотря на очевидные достоинства метод УЦ не нашел пока широкого применения. Лишь для органиченного числа ферментов, обладающих четвертичной структурой, определен молекулярный вес активно работающей формы [33—38].

Как правило, место локализации фермента в пробирке при проведении УЦ определяют по активности, а за распределением белка в градиенте сахарозы не следят. При седимёнтационном анализе НАД-киназы мы определяли место локализации фермента как по активности, так и по белку. УЦ подвергали электрофо-ретически гомогенные препараты а- и В-формы НАД-киназы с молекулярным весом 180 000 и 210000 соответственно. УЦ проводили как в присутствии, так и в отсутствие субстратов. По окончании УЦ градиенты фракционировали на 25—35 фракций и в каждой помимо активности определяли белок методом с кумас-си G-250 [39]. На рис. 5 представлены кривые распределения ак-

"598

Dfi

122000 2f>°° ¦I

1 1 V г

- \ ' м 1 - 0,1

1 1 »iV 1 1 1 1 0,1

70500 zwoo \ щооо ,

Рис. 5. Ультрацентрифугироваиие а- и 6-форм НАД-киназы. А — а-форма фермента, Мг 180 000; Б — 6-фориа фермента, М,210 000; I—в отсутствие субстратов; II — в присутствии субстратов (1.2 мМ НАД, 1,5 мМ АТФ и 10 мМ MgCb); / — белок (D595); 2 —активность (Dy»)\ стрелкой показано положение каталазы (М, 240 000). В случае УЦ в присутствии субстратов проводили дополнительную инкубацию после фракционирования градиента

тивности и белка в градиенте сахарозы после УЦ. Как можно видеть, при УЦ формы фермента в отсутствие субстратов (рис. 5. А, I) выявлены два пика активности, соответствующие белкам с М, 130000—135000 и 240000. Преобладающей по активности оказывается первая форма: на ее долю приходится до 90% общей

154

активности образца. Вторая форма является минорной по активности. Обратные соотношения наблюдаются в распределении белка по фракциям градиента. На минорную по активности форму с Мг 240000 приходится до 95% белка исследованного образца фермента. Исходя из молекулярного веса субъединицы а-формы НАД-киназы (33 000), можно считать, что форма с Мг 130 000 является тетрамером. При УЦ в присутствии субстратов (НАД+ -f-MgATO) картина распределения белка и профиль активности фермента незначительно изменялись в качественном отношении, но при этом происходили количественные изменения (рис. 5 А, II). Преобладающей по активности, как и при УЦ в отсутствие субстратов, остается форма с Мг 130000, однако доля этой формы по белку увеличивается с 5 до 10—15% и, что особенно важно, общая* активность образца при -УЦ в условиях работы фермента увеличивается примерно в 2,5 раза.

Создается впечатление, что в присутствии субстратов происходит переход некоторой части фермента из малоактивной или неактивной формы с Мг 240 000 в высокоактивную форму с Мг 130 ООО. По-видимому, следствием этого перехода в присутствии субстратов является активация фермента. Пятикратное увеличение концентрации субстратов не повышает доли активной формы белка. Значение Мг последней не зависит от ионной силы используемого буфера. При УЦ в присутствии субстратов, кроме двух основных форм, можно заметить целый ряд минорных, число которых варьирует от препарата к препарату. Среди них можно на-, звать мономер, димер и форму с Мг 370000. Помимо названных, всегда обнаруживается еще одна минорная, быстро седиментиру-ющая форма, которая за время УЦ (4—5 ч) доходит до дна центрифужного стакана. В дальнейшем было выяснено, что появление этой высокомолекулярной формы обусловлено образованием неспецифических агрегатов фермента.

Тот факт, что, несмотря на электрофоретическую гомогенность используемых в опытах по УЦ препаратов НАД-киназы, основная масса белка или обладает очень низкой каталитической активностью или не обладает совсем, может ставить под сомнение принадлежность этого белка к собственно НАД-киназе. Для решения возникшего вопроса проводили повторное УЦ неактивного белка. С этой целью из нескольких пробирок объединяли фракции, содержавшие неактивный белок, и после соответствующего разведения и концентрирования около 40 мкг белка подвергали повторному УЦ. Снова обнаруживали активную форму с Мг 130 000.

Полученный результат дает основание полагать, что неактивный белок, представляет собой потенциально активную форму фермента, .способную в определенных условиях переходить в каталитически активную.

Мы попытались обнаружить активную тетрамерную форму методом электрофореза в градиенте ПААГ. Для повышения доли активной формы гомогенный препарат фермента а-типа с Мг 180000 инкубировали с субстратами в течение 2 сут при +4° С,

после чего подвергали электрофорезу. Оказалось, что электрофо-реграмма белка после такой обработки не изменилась и демонстрировала всего одну белковую полосу с Мг 180 000; тетрамера обнаружить не удалось. В то же время анализ этого же препарата методом УЦ показал значительный переход неактивной формы фермента в активную, тетрамерну

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)