му НАД-киназы [17]. При этом из двух форм фермента а-типа с молекулярным весом* 150 000 и 180000 в большей степени активируется первая, наименее активная форма. На первый взгляд эти данные трудно объяснить действием одного активатора. Для интерпретации полученных результатов проще всего было бы допустить присутствие-в использованных частично очищенных препаратах, помимо активатора, еще и ингибитора фермента. Для многих ферментов показана ^возможность регуляции каталитической активности пра участии как активатора, так и ингибитора. Очевидно, что конечный эффект будет зависеть только от соотношения активатор/ин-. гибитор в используемых препаратах. Активация может наблюдаться, когда действие активатора преобладает над действием ингибитора. В противном случае выявляется ингибирование фермента. Эффект отсутствует, когда действие активатора уравновешивается действием ингибитора.

Мы придерживаемся иной точки зрения при объяснении полученных результатов и исходим из того, что между ферментом и. регулятором в зависимости от концентрационных соотношений могут образовываться различающиеся по стехиометрии комплексы с разной каталитической активностью. Высказанная точка зрения нашла экспериментальное подтверждение. Как следует из: данных, представленных на рис. 4, можно наблюдать оба эффекта — активацию и ингибирование, добавляя разные количества частично очищенного препарата регулятора к одному и тому же: количеству фермента.

150

Особое внимание следует обратить на тот факт, что обнаруженный регулятор активности при добавлении к гомогенному (ферменту возвращает НАД-киназе утраченное ею свойство, характерное для диссоциирующей ферментной системы, а именно .зависимость удельной активности от концентрации фермента (см. рис. 2 В, 2). Как можно видеть, действие фактора специфическое, так как добавление сывороточного альбумина быка к очищенному ферменту в тех же концентрациях не оказывает влияния иа активность фермента при изменении концентрации последнего в инкубационной среде (рис. 2 В, 3).

Рис. 4. Кривая титрования НАД-киназы из. печени кролика регулятором.

По оси ординат — активность, % (за 100% принята активность пробы без добавления регулятора), по оси абсцисс — количество добавленного регулятора в мкг белка частично очищенного препарата, мкг. Фермент: В-форма НАД-киназы, Мг 210 ООО, добавлен в количестве 5 мкг иа пробу

В настоящее время мы не располагаем прямыми данными относительно изменения четвертичной структуры НАД-киназы из печени при добавлении активатора к гомогенному ферменту. Однако тот факт, что в присутствии активатора очищенный фермент вновь демонстрирует зависимость удельной активности от концентрации белка в среде инкубации, дает основание предположить, что фактор, отделяемый от фермента при ионообменной хроматографии, может способствовать, как и в случае 3-фосфо-глицераткиназы, переходу фермента из одного олигомерного состояния в другое.

В сердце голубя также был обнаружен фактор, способный активировать НАД-киназу. В качестве источника активатора использовали надосадочную ^жидкость, остающуюся после осаждения комплекса НАД-киназы с протаминсульфатом на одной из стадий очистки. Супернатант прогревали в течение 10 мин на кипящей водяной бане, отделяли коагулировавшие белки н фракцию, содержавшую активатор, получали путем высаливания сульфатом аммония до 60%-ного насыщения с последующим диализом. Как следует из данных табл. 2, эта термостабильная белковая фракция активирует НАД-киназу из сердца голубя в 1,3— 2,0 раза в зависимости от добавленного количества. По-видимому, как и в случае фермента из печени, эффект активатора на НАД-киназу из сердца голубя специфичен, так как добавление БСА в' том же количестве не оказывало никакого влияния на активность фермента.

Следует заметить, что активирующая НАД-киназу фракция

151

из сердца голубя способна также активировать НАД-ки-назу из печени кролика. В свою очередь добавление-фракции, содержащей активатор из печени кролика, вызывает активацию фермента из; сердца голубя.

В настоящее время фактор — регулятор активности НАД-киназы из печени кролика и сердца голубя — ие выделен в гомогенном состоянии. Выделение и очистка регулятора активности НАД-киназы представляются задачей первостепенной важности. Имея очищенный активатор, можно будет однозначно решить вопрос о его участии в поддержании четвертичной структуры и о влиянии на степень олигомеризации фермента, а следовательно, о той роли, которую он играет в регуляции каталитической активности.

Возникает вопрос, не является ли этот фактор белком, подобным кальмодулину. Судя по имеющимся данным, активатор НАД-киназы из сердца голубя и печени кролика существенно отличается от кальмодулина. Так, кальмодулин-активатор НАД-киназьв из высших растений и яиц морского ежа прочно связывается; с ионообменником и сходит с колонки значительно позже НАД-киназы, тогда как активатор фермента из печени кролика в тех же условиях вовсе не связывается с ионообменником. Далее, фермент из растительных объектов после отделения кальмодулина полностью утрачивает активность, что дало основание рассматривать кальмодулин как субъединицу этих ферментов. НАД-киназа из сердца голубя и печени кролика после ионообменной хроматографии сохраняет активность; более того, наблюдается значительная очистка фермента за счет отделения примесных белков. Однако при этом разрушается четвертичная структура фермента-из сердца голубя, который после такой процедуры представляет собой мономер, не способный к ассоциации.

Следует признать, что сам факт сохранения активности фермента после фракционирования на ионообменнике хотя и является признаком, по которому различаются НАД-киназы животного и растительного происхождения, тем не менее он ие исключает возможности регуляции кальмодулином активности фермента изг животных тканей. Прямой ответ на поставленный вопрос можно-было бы получить только исследуя влияние очищенного кальмодулина на гомогенный препарат фермента из печени кролика № сердца голубя.

Интересно отметить, что НАД-киназа из проростков гороха также представлена множественными формами. Было обнаруже-

Таблица 2

Влияние активатора на активность НАД-киназы из сердца голубя (24)

пробы Ф«р мент, мкг Активатор, мкг БСА, мкг Активность, ед./иг

1 96 0,80

2 96 120 — 1,06

3 96 360 — 1,37

4 96 600 — 1,61

5 96 — • 120 0,80

6 96 — 360 0,80

7 96 — 600 0,80

152

ио [9] по крайней мере 5 таких форм. Вопрос о -природе множественных форм НАД-киназы из проростков гороха остался открытым. Отсутствуют какие-либо сведения о молекулярном весе этих ¦форм. Нельзя исключить, однако, возможности того, что добавление кальмодулина к неактивному или частично сохранившему .активность ферменту могло бы наряду с активацией привести к изменению степени ассоциации белка. -:

Как было уже сказано, фермент из печени кролика, в отличие ¦от фермента из сердца голубя, сохраняет четвертичную структуру после ионообменной хроматогра