Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

ации, в присутствии цАМФ или при добавлении разных концентраций.

147

;фер мента. В двух последних случаях удавалось наблюдать нормализацию зависимости v от fS]Q, которая из сложной превращалась в гиперболическую, что могло служить указанием на смещение равновесия в сторону одной из форм фермента.

Изменение концентрации субстрата практически не влияло на ¦форму кривой а от [Е]0 для препарата из сердца голубя, что, по-видимому, можно объяснить большим вкладом в смещение равновесия между олигомерами изменения концентрации фермента, хотя даже при десятикратном повышении концентрации последнего в пробе кривая v от [S]0 не превращалась в гиперболу. .Эти данные можно рассматривать как указание на то, что сдвиг равновесия между молекулярными формами в препарате фермента из сердца голубя осуществляется "менее легко, чем в ферментном препарате из скелетных мышц.

Известно, что кооперативные эффекты в диссоциирующих ферментных системах могут быть обусловлены как смещением равновесия между олигомерами, так и взаимодействием активных центров внутри каждого олигомера [21]. Рассмотренные факты позволяют оценить вклад первого типа взаимодействий.

Следует подчеркнуть, что характерные для диссоциирующих -систем свойства НАД-киназа утрачивает после очистки до гомогенного состояния. По-видимому, НАД-киназа принадлежит к ферментам, слишком высокая степень очистки которых приводит к изменению или даже исчезновению регуляторных свойств.

Точку зрения о необходимости осторожного подхода к оценке результатов, получаемых при исследовании высокоочищенных ферментов, высказывают в своей монографии Э. Ньюсхолм и К. Старт [1]. Они указывают на то, что следует стремиться к достижению известного компромисса между использованием частично очищенных препаратов, в которых с наибольшей вероятностью сохраняются регуляторные свойства фермента, и изучением ¦свойств очищенных до гомогенного состояния ферментов.

Регулятор НАД-киназы

Теперь попытаемся ответить на вопрос, что же происходит с НАД-киназой после фракционирования на ионообменникё и очистки фермента до гомогенного состояния.

Электрофоретически гомогенные ферменты отличаются большой лабильностью и быстро, инактивируются при хранении. •Отмечали также крайнюю неустойчивость фермента после ионообменной хроматографии НАД-киназы из пивных дрожжей [20] и проростков гороха [9]. Причем фермент из растений в отдельных случаях, а НАД-киназа из яиц морского ежа постоянно [28] после указанной процедуры инактивировались полностью.***Причи-иа инактивации заключалась в том, что в процессе ионообменной хроматографии от фермента отделялся фактор, в отсутствие которого НАД-киназа не проявляла активности. Фактор более прочло, чем фермент, связывался с ДЭАЭЦ и сходил с колонки при

148

<5олее высоком значении ионной силы буфера. Этим термоста-•бильным, недиализуемым фактором оказался кальмодулин [29, ¦30]. Помимо фермента из проростков гороха фактор активировал .НАД-киназу из большого числа растительных объектов [9, 29]. Активирующий эффект кальмодулина проявлялся только в присутствии ионов кальция. При добавлении кальмодулина или содержащей его фракции, получаемой при фракционировании на «онообменнике, к неактивной НАД-киназе из проростков гороха лрермент полностью восстанавливал активность. Полное восстановление активности наблюдали также при добавлении кальмодулина из мозга свиньи к НАД-киназе из яиц морского ежа, инак-тивированной после пропускания через колонку с ДЭАЭ-сефадек--сом А-25 [28].

Идентичность кальмодулина из растительных и животных тка-лей была продемонстрирована в опытах по перекрестной актива-щии ферментов [29]. Кальмодулин растительного происхождения активировал фосфодиэстеразу из мозга быка, и, обратно, кальмодулин, полученный из мозга свиньи, восстанавливал активность НАД-киназы из проростков гороха. Кальмодулины растительного ж животного происхождения обнаружили сходство и по ряду других свойств, таких, как молекулярный вес, аминокислотный состав, способность взаимодействовать с тропонином I, утрачивать .активирующее действие в присутствии фенотиазина [30].

НАД-киназа из сердца голубя и печени кролика не теряла активности после ионообменной хроматографии в отличие от фермента из проростков гороха, однако очищенный, фермент утрачивал прежние свойства диссоциирующей ферментной системы.

В настоящее время трудно ответить на вопрос о том, почему •фракционирование на ионообменнике сопряжено с разрушением четвертичной структуры НАД-киназы из сердца голубя. Можно высказать лишь предположение, что по аналогии с ферментом яз проростков гороха в процессе ионообменной хроматографии от НАД-киназы отделяется фактор; в отсутствие которого последняя утрачивает свойства регуляторной диссоциирующей ферментной системы. Принципиальная возможность регуляции степени ассо-диации фермента при помощи специфического фактора показана для 3-фосфоглицераткиназы из ряда объектов [31]. Авторы работы установили, что молекулярный вес частично очищенного •фермента может колебаться от 43 000 до 160000 в зависимости от условий гель-фильтрации через колонки с сефадексом G-100 или G-150, а после фракционирования на ионообменнике ДЭАЭ-сефа-дексе А-50 фермент утрачивает способность к ассоциации —- диссоциации, и независимо от условий гель-фильтрации молекулярный вес его остается неизменным и равным 43000. При этом •было замечено, что в процессе ионообменной хроматографии с колонки смывается фракция, содержащая низкомолекулярный, термостабильный фактор, при добавлении которого к очищенному ферменту с молекулярным весом 43000 последний вновь приобретает утраченную способность образовывать более высокомолеку-

149

лярные формы. Фактор прочно сорбировался на колонке, и элю-ировался при более высоком значении ионной силы раствора, чем фермент.

При анализе белковых фракций, смываемых с колонки при ионообменной хроматографии НАД-киназы из печени кролика, был обнаружен фактор, способный изменять активность фермента. Этот фактор не связывается с ионообменником и выходит при нанесении образца фермента на колонку в первой белковой фракции. Вопрос о том, какова его природа и не является ли он кальмодулином, будет рассмотрен ниже. Фактор не обладает ферментативной активностью, термостабилен (его эффект сохраняется после прогревания в течение 5—7 мин при 10СР *?), не проходиг через мембрану при диализе или ультрафильтрации. При исследовании действия фактора на НАД-киназу из печени кролика мы не всегда наблюдали однозначный эффект, что выражалось в следующем. Во-первых, степень активации варьировала в широких пределах (от 30 до 150%). а при большом избытке фактора наблюдали даже десятикратную активацию. Причина неодинаковой активации, по-видимому, кроется в различном содержании самого активатора в разных частично очищенных препаратах, используемых в опыте. Во-вторых, фактор оказывал влияние не на все препараты фермента. Степень активации зависела также от типа НАД-киназы (а или р). Было выяснено, что более выражено активирующее действие фактора на а-фор

страница 51
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.11.2019)