ых множественных форм в литературе нет единой точки зрения. Полагают, что ММФ НАД-киназы, обнаруженные в гиалоплазме и митохондриях дрожжей [11], у Triatoma infestans при интоксикации ДДТ [8], в частично очищенных препаратах из проростков гороха [9], являются изозимами. Можно думать, что ММФ фермента из наружных сегментов глаза быка [14] н из Azotobacter vinelandii [15] представлены конформерами, тогда как НАД-киназа из скелетных мышц кролика [2—4], сердца голубя [5, 7] и печени кролика [6] представляет собой диссоциирующую ферментную систему,

«36

состоящую из олигомеров разной степени ассоциации, обладающих раздичной каталитической активностью.

В настоящем обзоре- предпринята попытка обобщить результаты, полученные главным образом при изучении свойств НАД-ки-наз из трех последних источников: скелетных мышц кролика, сердца голубя и печени кролика. Основное внимание будет уделено рассмотрению тех изменений в четвертичной структуре фермента, которые происходят в процессе его очистки до гомогенного состояния, и выяснению возможных причин, лежащих в основе наблюдаемой при этом частичной или полной утраты очищенным ферментом регуляторных свойств.

Четвертичная структура НАД-киназы

Для изучения четвертичной структуры НАД-киназы из скелетных мышц кролика использовали препараты фермента, очищенные в 150—300 раз. Тремя независимыми методами: электрофорезом в однородном геле и в градиенте концентрации полиакриламидно-го геля, путем разделения в тонком слое сефадекса G-200, с по* мощью гель-фильтрации через колонку с сефадексом G-200 — была обнаружена большая гетерогенность препарата в отношении НАД-киназы [2, 4]. Локализацию фермента в геле определяли по измерению активности в элюатах, полученных после разрезания столбика геля на диски толщиной 2 мм. При это оказалось, что по данным диск-электрофореза в однородном геле ферментативной активностью обладают четыре зоны, характеризующиеся значениями Rf 0,1, 0,52, 0,73 и 0,98. Повторный электрофорез белка с электрофоретической подвижностью, близкой к 1,0, после его элюции и концентрирования обнаружил несколько белков с более низким, чем у исходного, значением Rf (0,73, 0,52, 0,07).

Пять белковых зон, проявляющих ферментативную активность, были выявлены с помощью метода тонкослойной гель-фильтрации через сефадекс G-200. Значения*молекулярных весов обнаруженных форм фермента колебались в пределах от 40000—45000 до 280 000—300000. Было показано, что каждая из пяти полученных в результате гель-фильтрации фракций при последующем диск-электрофорезе разделяется на несколько белковых зон, среди которых преобладают зоны с одинаковой электрофоретической по-•движностью: 0,52, 0,73 и 0,98. Формы с более низким значением Rf обнаружены во фракциях, содержащих высокополимерные белки. Полученные при электрофоретической анализе и гель-фильтрации экспериментальные данные свидетельствуют о присутствии в препаратах НАД-киназы нескольких форм фермента. Показана возможность перехода одних форм в другие. Иными словами, исследованные препараты фермента содержат равновесную систему множественных молекулярных форм, различающихся по молекулярному весу и способных осуществлять взаимные переходы. В процессе гель-фильтрации эти формы разделяются по молекулярному весу, а последующие процедуры элюции и концентриро-

137

вания белка перед электрофоретическим анализом и в процессе самого электрофореза создают условия для перехода одних форм в другие.

Присутствие ММФ в препаратах НАД-киназы из скелетных мышц кролика было продемонстрировано также при фракционировании на колонке с сефадексом G-200 (3), а значения молекулярных весов олигомеров фермента были уточнены с помощью метода электрофореза в линейном градиенте концентрации поли-акриламидного геля (ПААГ) [16]. Результаты, полученные при исследовании фермента двумя указанными методами, показали, что в частично очищенных препаратах НАД-киназы присутствуют олигомеры фермента с молекулярными весами 31000, 65000, 94 000, 160 000, 220 000, 350 000. Наименее ассоциированной формой НАД-киназы является белок с молекулярным весом 31 000, который, по-видимому, можно считать субъединицей фермента на том основании, что после обработки додецилсульфатом натрия двух низкомолекулярных фракций, снятых с колонки (31 000, 65 000), и последующего электрофореза на электрофореграммах не был обнаружен белок с молекулярным весом, меньшим 30 000.

Проведенное исследование четвертичной структуры НАД-киназы из скелетных мышц кролика указывало на присутствие в препарате фермента равновесной системы диссоциирующих олигомеров, состоящих из различных сочетаний субъединиц с молекулярным весом равным 31 000.

При изучении свойств НАД-киназы из скелетных мышц использовали высокоочищенные, но ие гомогенные препараты НАД-киназы. Препарат фермента из сердца голубя был электро-форетически получен в гомогенном состоянии. Метод выделения и очистки в качестве последних стадий включал ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и гель-фильтрацию на сефароэе 6В [5]. Сравнение свойств частично очищенных и гомогенных, по данным электрофореза, препаратов фермента позволило установить следующую закономерность. Частично очищенные ферментные препараты НАД-киназы из сердца голубя подобно ферменту из скелетных мышц кролика гетерогенны и представлены не менее чем пятью молекулярными формами, число которых могло варьировать от препарата к препарату: НАД-киназную активность проявляли формы с молекулярными весами, равными 300 000—270 000, 230 000—200 000, 180 000, 120 000 и 45 000. Из распределения общей активности фермента между различными молекулярными формами следует, что большая часть НАД-киназы представлена олигомерами с молекулярным весом 180000.

Присутствие ММФ в частично очищенных препаратах НАД-киназы из сердца голубя' было продемонстрировано также методом гель-фильтрации на колонках с сефадексом G-200. На рис. 1 представлены профили элюции двух препаратов НАД-киназы. Можно видеть, что в процессе гель-фильтрации с колонки сходит один асимметричный пик белка. Активностью обладают фракции с молекулярными весами 270000—240 000, 230000—210000,

«8

280

нмт/ч-м/r

230000 1180000

J

180000 и 85 000—90 000. Сравнение кривых элюирования двух препаратов НАД-киназы показало различия в количественном соотношении между олигомерами с высоким и низким молекулярными весами. В препарате I на долю олигомера с молекулярным весом 90000 приходится до половины общей ферментативной активности, тогда как препарат II содержит преимущественно высокоассоциированные формы фермента.

Значения молекулярных весов разных форм НАД-киназы, определенные методом гель-фильтрации, совпадают с величинами, определенными методом электрофореза в градиенте концентрации ПААГ, за исключением низкомолекулярной формы НАД-киназы с молекулярным весом 45000, которую при гель-фильтрации обнаружить не удавалось. Однако при анализе сошедшей с колонки фракции НАД-киназы, имеющей молекулярный вес 90000, методом электрофореза в градиенте концентрации ПААГ было показано наличие