Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

и различных концентрациях бруфена (мкМ).

На а: 1 — 0; 2 — 8; 3 — 15; 4—25; 5 — 35; 6 — 50; на б: 1 — 0; 2 — 25; 3 — 50;

4 — 126. Условия: 32°С, рН 7,2, 20 мМ фосфат, 1,6% этанола, 0,1% твин-20, гемин 1,8 мкМ, 1,1 мМ адреналина (а); 73,5 мкМ арахидоновой кислоты (б)

Изучение механизмов обратимого ингибирования ферментативных реакций — предмет детального анализа в энзимологической литературе :[28]. Однако анализ-закономерностей ингибирования ферментов был посвящен в основном односубстратным реакциям. Очевидно, что многосубстратная природа реакций должна весьма специфическим образом отражаться в кинетике ингибирования, и для многосубстратных реакций должны существовать особые закономерности ингибирования. Рассмотрим эти закономерности для случая упорядоченных механизмов реакций.

Как показано ранее, механизмы двухсубстратных ферментативных реакций можно разбить на два принципиально различающихся класса по зависимости скорости реакции от концентрации обоих субстратов. Первую категорию реакций составляют процессы, уравнения скорости для которых не содержат произведения концентраций двух субстратов. Эта категория реакций, механизмы которых получили название механизмов с немультиплицирующи-"ми субстратами. Было показано, что необходимым условием для реализации данного типа механизма является наличие по крайней мере одной необратимой стадии между двумя пунктами ввода суб-

Обратимое ингибирование многосубстратных ферментативных реакций

стратов в механизм превращения. Простейшую каноническую схему такой реакции можно представить в виде

Для простоты примем, что стадии ввода субстратов являются обратимыми и быстрыми и могут быть охарактеризованы константами равновесия (комплексы субстратов с активными центрами ферментов).

Второй класс реакций образуют процессы, уравнения "скорости для которых включают произведение концентраций субстратов. Это реакции с так называемыми мультиплицирующими субстратами. Необходимым условием реализации мультиплицирующего механизма является обратимость всех стадий между двумя точками ввода двух различных субстратов. Простейшая каноническая схема для механизма с мультиплицирующими субстратами может быть записана в виде

s, Sa fe

X^X^Xs-^X,. (9) Kt к.

Предполагается, что стадии ввода субстратов являются обратимыми, быстрыми и могут быть охарактеризованы константами равновесия Ki и Кг-

Рассмотрим зависимости скорости от концентраций обоих субстратов и концентрации обратимого ингибитора для механизмов обоих классов. Очевидно, что ингибитор может взаимодействовать со свободной формой фермента Xt или с различными интермедиа-тами ферментсубстратных превращений.

Кинетические закономерности ингибирования двухсубстратной реакции с немультиплицирующим механизмом ^суммированы в табл. 1. В ней приведены кинетические схемы взаимодействия ингибитора с ферментом, уравнения стационарной скорости реакции в обратной форме, а также координаты точки пересечения прямых зависимости 1/v от l/Si или от 1/S2 при различных концентрациях ингибитора (если такая точка пересечения существует). Рассмотрены механизмы, по которым ингибитор взаимодействует с одной из форм активного центра {Х±, Х2, Хз, Х4), с какими-либо двумя, тремя формами либо со всеми четырьмя состояниями активного центра.

Вариация стадий взаимодействия ингибиторов с интермедиата-ми ферментативной реакции приводит к 14 различным механизмам.

Проводя экспериментальное изучение зависимости скорости реакции от концентрации субстратов и ингибитора, механизмы реакций можно в значительной степени дискриминировать. Анализ данных, приведенных в табл. 1, показывает, что все представленные механизмы приводят к шести различным вариантам зависимостей скорости от концентрации первого или второго субстрата

13

Таблица 1

Закономерности ингибирования двухсубстратной реакции. Случай упорядоченного

S, kt St *t

механизма для немультиплицнрующих субстратов, схема Xi ^ Х2 -*¦ Х3 ^ Х*-* Х\

К. К,

№ п/п Стадии взаимодействия с ингибитором Уравнение стационарной скорости Координата точки пересечения прямых при различных концентрациях ингибитора зависимость 1/в от 1/S, зависимость

Продолжение табл. 2

Стадии взаимодействия с ингибитором

Уравнение стационарной скорости

Координата точки пересечения прямых при различных концентрациях ингибитора

зависимость 1/и от 1/S,

зависимость I/» от \/Sa

X2+l

Ki

(1)

XJ

(2)

XJ

(1)

Ki

X2+f ^ XJ

J2)

x3+f

Xi+f

x2+i x3+t

XJ

(I)

XJ

Kl

(2)

XJ

Ki

(3)

XJ

V

+ ¦

KiK2

kSxS2

к!»

+

к.

1 +¦

_Eo_

V

KiK2 к

T

kS\S2

+

1 / I

V

+

kSxS2 K2

+

[kS2

1 + ?p>

+

l 7 /

(1/Si)n =

(1/Si)e =

(1/Sa)„=0

(1/S2)„ = '

(i/s2)„ =

1/K<3>

K\K2 K2 -r'

sxk\" , кр

при- различных концентрациях ингибитора. Графический вид этих •вариантов также различен.

Кинетические закономерности ингибирования реакций, протекающих по мультиплицирующему механизму, приведены в табл.2. Как и в случае немультиплицирующих субстратов, в таблице даны кинетические схемы, отличающиеся по интермедиатам, с которыми реагирует ингибитор.

Для каждого механизма ингибирования характерен свой собственный вид зависимости скорости от концентрации субстратов я ингибиторов. Другими словами, механизм ингибирования может <5ыть строго идентифицирован из данных по стационарной кинетике реакции.

Проведенный анализ иллюстрирует многообразие как возможных экспериментально наблюдаемых зависимостей, так и кинетических механизмов ингибирования многосубстратных реакций. Однако для случая нестероидных противовоспалительных средств — ^быстрых обратимых ингибиторов PGH-синтетазы — может быть строго выявлен однозначный механизм ингибирования.

Нестероидныё противовоспалительные препараты (бруфен, напроксен, бутадиен, анальгин) конкурентно вытесняют арахидоновую кислоту из активного центра PGH-синтетазы

Ъ реакции окисления арахидоновой кислоты до простагландина На арахидоновая кислота и донор электронов выступают как не-, '-мультиплицирующие субстраты. В работах '[27, 29] были детально рассмотрены результаты исследования кинетики действия PGH-синтетазы и строго показана немультипликативность этих двух субстратов. Кинетика действия PGH-синтетазы включает целый набор интермедиатов, однако без ущерба для общности рассмотрения юна может быть описана простейшей кинетической схемой (8), где Xi — свободная форма фермента, Xz — комплекс фермента с арахидоновой кислотой, — комплекс фермента со вторым субстратом, kt, kz — лимитирующие стадии химической трансформации.

Сопоставление экспериментально наблюдаемых зависимостей •скорости реакции от концентраций субстратов и ингибитора (см. рис. 7) с теоретическими зависимостями, приведенными в табл. 1, показывает, что экспериментальные данные соответствуют кинетической схеме (1) в табл. 1 и имеют единственное истолкование: ингибитор взаимодействует со свободной формой фермента, конкурентно вытесняя арахидоновую кислоту из активного центра.

Следует отметить важ

страница 4
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.10.2019)