ции /V-белка с каталитическим белком [10, 27, 28, 125]. Эндогенно связанный ГДФ до тех пор, пока не будет вытеснен из нук-леотид-связывающего центра, мешает проявлению воздействия гуанозинтрифосфатов на связывание агониста с р-рецептором и на активацию аденилатциклазы в эритроцитах голубя [95].

Для наблюдаемого в ряде мембранных систем [67, 74, 138, 139] слабого активирующего действия на аденилатциклазу ГДФ и ГДФрБ характерным и общим наблюдением является увеличение лишь стимуляции под действием гормона и ингибирование в отсутствие гормонов ГТФ- или GppNHp-зависимой стимуляции. Возможно, что во всех этих случаях активирующее действие ГДФ н ГДФрБ объясняется увеличением под действием этих нуклеотидов степени сопряженности гормон-рецепторного комплекса с /V-бел-ком. Это предположение подтверждается тем, что действие гуа-• ниловых нуклеотидов на рецептор находится под одинаковым контролем со стороны ГДФ и ГТФ в некоторых аденилатциклазных системах [70, 79, 84, 86].

Однако точная роль, которую играет у-фосфат в изменениях /•/-белка, не известна.

Особый интерес исследователей привлекает до сих пор не расшифрованный механизм активации /V-белка под действием фтор-анионов. Фтор-анионы вызывают такие же изменения гидродинамических параметров /V-белка, как негидролизуемые гуанило-вые нуклеотиды [14, 15, 17], что приводит к ассоциации /V-белка

/

с каталитическим белком и активации каталитической субъединицы. Mg2+ увеличивает эффект фторида на мембранах [81] во время реконструкции [111]. Йенгр и Бирнбаумер [118] показали, что Mg2+ абсолютно необходим для фторидной стимуляции, так же как и для нуклеотидной. Однако есть данные о том, что фто-ридная активация соответствует менее устойчивым изменениям /V-белка, чем нуклеотидная. Так, в растворе активация гомогенного /V-белка из печени кролика фторидом, в отличие от активации под действием ГТФуБ, обращается при удалении ионов фтора гель-фильтрацией [14]. Тиол-восстанавливающие агенты уменьшают степень ассоциации /V-белка с каталитическим белком, вызываемую фторидом, но не GppNHp [57]. Нестабильность фторидной активации в растворе явилась причиной уменьшенной молекулярной массы фтор-активированной аденилатциклазы по сравнению с молекулярной массой GppNHp-активированного фермента [58, 59].

Различия двух видов активации /V-белка следуют также из того наблюдения, что модификация YV-белка АДФ-рибозилирова-нием увеличивает ГТФ-зависимую стимуляцию аденилатциклазной активности и в то же время ингибирует фторидную активацию [24, 72, 103, 140]. Причем для ингибирования фторидной стимуляции требуется большая глубина модификации /V-белка, чем для появления высокой ГТФ-зависимой активации.

Фторид, по-видимому, может стимулировать /V-белок, не занятый гуаниловыми нуклеотидами, так как после обработки мембран эритроцитов индюка ЭДТА в присутствии изопротеренола, вытесняющей гуаниловые нуклеотиды, фторидная активация в присутствии Mg2+ все равно происходит [141]. Фторид не изменяет параметров связывания нуклеотидов в регуляторной участке /V-белка [127]. Однако гуаниловые нуклеотиды могут модулировать величину фторидной активации, так как посадка ГМФ в свободном нуклеотид-связывающем центре /V-белка предотвращает, ее [127]-ГДФВБ также мешает фторидной стимуляции [127, 138] и возвращению фторидной чувствительности мембранам клеток сус~ при реконструкции [126]. Однако другие нуклеотиды (ГДФ, ГТФ,. GppNHp) увеличивают фторидную стимуляцию [127, 142]. Фторид способствует также ассоциации оккупированного ГДФ /V-белка с каталитическим [28, 118]. Таким образом, в механизме активирующего действия фторида по-прежнему остается много неясных моментов. На наш взгляд, особенно интересным является тот факт, что в присутствии ГДФ фторид может переводить /V-бе--ок в активированное состояние, т. е. отсутствие у-фосфата у вза-. имодействующего с /V-белком нуклеотида еще не является абсолютно ограничивающим активацию фактором.

\

Каталитический белок аденилатциклазного комплекса. \ Строение его активного центра

Активация аденилатциклазы в ответ на гормональный сигнал происходит в результате прочного белок-белкового взаимодействия N-белка с каталитическим белком. В результате этого увеличивается максимальная скорость ферментативной реакции. В отличие от медленных изменений N-белка активация каталитического* белка происходит быстро. Быструю и обратимую активацию каталитического белка ' может осуществлять дитерпен форсколин,-выделяемый из корней Coleus forskohlii [143]. Эта активация не опосредована через N-белок, кальмодулин или через рецептор, так как осуществляется в мембранах клеток сует и не ингибируется под действием ЭГТА, р-блокаторов или ГДФрЗ. Форсколин неизменяет структуру мембраны, так как активируется и растворимая аденилатциклаза из семенников крыс, и солюбилизированная аденилатциклаза из мозга крысы. Причем в семенниках крыс форсколин переводит каталитический белок из Мп2+-чувствительного-в М^2+-чувствительное состояние. Предполагают, что форсколин» взаимодействует непосредственно с каталитическим белком или* с еще не известным компонентом аденилатциклазного комплекса. Но не исключена возможность модуляции активности и N-белка,. так как некоторые гормоны активируют аденилатциклазу сильнее-в присутствии форсколина [144].

Примером другого взаимодействия, приводящего к активации каталитического белка, является его взаимодействие с кальмоду-лином. В лаборатории Нира отделенный от N-белка каталитический белок из мозга активировался кальмодулином, и при реконструкции с N-белком кальмодулин не влиял на скорость и величину активации аденилатциклазы под действием GppNHp [145], Независимость кальмодулиновой активации от ГТФ и аддитивность ее с активацией аденилатциклазы под действием GppNHp-показаны также на частично очищенной аденилатциклазе из мозга» быка [146]. Кроме того, кальмодулин активирует нечувствительную к гуаниловым нуклеотидам и не содержащую N-белка аденилатциклазу из Bordetella pertussis [147]. В настоящее время-трудно сказать, какое физиологическое значение может иметь стимуляция аденилатциклазы под действием кальмодулина, которая,., судя по аддитивности двух эффектов, может осуществляться путем, отличным от механизма активации аденилатциклазы гормонами.

Как было показано недавно [148], каталитический белок аденилатциклазы из клеток сус- содержит аллостерический центр-связывания двухвалентных катионов, который имеет высокое сродство к Мп2+ (Кт=0,3—0,7 мМ) и низкое сродство к Mg2+ (Кт= = 2—6 мМ). Во время реконструкции с предварительно активированным N-белком из мембран эритроцитов индюка активация-каталитического белка существенно зависит от наличия в среде свободных ионов Mg2+, т. е. определяется работой аллостерическо-

113:

го центра, скорее всего, расположенного на каталитическом белке и идентичного аллостерическому центру, определяемому в отсутствие N-белка.

Не установлена роль так называемого Р-участка, ответственного за ингибирование аденилатциклазы аденозином и его аналогами [149]. Р-участок специфичен к пуриновому о