Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

еотидами [22, 41, 42, 48]. В интактных мембранах большие концентрации Мп2+ могут приводить к нарушению сопряжения компонентов аденилатциклазного комплекса, т. е. к снижению гормональной стимуляции и ослаблению эффектов гуаниловых нуклеотидов [49, 50].

2 Знаками R, С н N обозначены рецепторный, каталитический и регуляторный белки аденилатциклазного комплекса соответственно.

98

Б комплексе с регуляторный белком каталитический белок обнаруживается практически во всех экстрактах тканей, если для экстракции используют неионные детергенты типа луброл или тритон или дигитонин при низкой ионной силе [14]. О существовании связи каталитического белка с N-белком в экстрактах свидетельствуют и наличие регуляции фторидом и гуаниловыми нуклеотидами, и низкая величина отношения активности, измеряемой •в присутствии Мп2+, к активности, измеряемой в присутствии Mg2+. Даже в том случае, когда Нир с сотр. разделяли аденилатциклазу на две фракции, одна из которых не была чувствительна к гуаниловым нуклеотидам, эта фракция не обладала свойствами собственно каталитического компонента и, как предполагают авторы, представляла собой слабодиссоциирующий комплекс каталитического белка с N-белком [51].

Равновесие C+N+&N—С в экстрактах, по-видимому, настолько сдвинуто вправо [52], что возникает серьезная проблема полного разделения С и N. Она осложняется тем, что каталитический белок, взятый отдельно, весьма нестабилен при очистке. Методами гель-фильтрации [51], аффинной хромотографии N-белка [6] или -аденилатциклазы, имеющей сродство к кальмодулину [53, 54], удается добиться лишь частичного разделения N-белка и каталитического белка.

Определенные перспективы открылись при использовании хо-лата натрия в сочетании с высокой ионной силой, создаваемой сульфатом аммония. Росс [9] показал, что в этих условиях сульфат аммония вызывает диссоциацию комплекса С—N и аггрега-цию каталитического белка и предотвращает инактивацию каталитической субъединицы. Таким же образом разделили N-белок м каталитический белок мозга Штриттматтер и Нир [10]. Лондос •с сотрудниками, использовавшие для солюбилизацин каталитического белка дезоксихолат натрия и меньшую ионную силу, получили в 20 раз более низкий выход активности по сравнению с результатами, полученными Россом [41]. Битонти с сотр. [55] недавно сообщили, что цвиттерионное производное холата также .дает хорошее разделение N-белка и каталитического белка в отсутствие сульфата аммония, что позволяет повысить стабильность получаемых компонентов.

О реальном существовании комплекса С—N не только в экстрактах, но также в мембранах свидетельствует меньшая величина "молекулярной массы аденилатциклазной мишени, определяемая в присутствии Мп2+ и в отсутствие других эффекторов аденилатциклазной системы, по сравнению с величиной, определяемой в присутствии Mg2+ [39].

По-видимому, состояние равновесия C+N^N—С отражается на определяемой величине молекулярной массы аденилатциклазы [51, 56, 57]. В тех случаях, когда N-белок не отделяли от каталитического, измеряемая молекулярная масса аденилатциклазы в экстрактах варьировала от 159 000 дальтон в почках крыс [21], 170 000 в почках морских свинок [58] и 119 000 дальтон в щито-

99

видной железе быка [59] до 220 000 и 199 000, 265 000 дальтон в мозговой ткани [18, 51]. После активации аденилатциклазы под действием гуанилил-б'-имидодифосфата (GppNHp) или фторида определяемая молекулярная масса не изменялась сколько-нибудь существенно, она составляла в клетках лимфомы 549 220 000 дальт тон [4], в печени крыс — 183—220000 дальтон [60]. К сожалению, в тех случаях, когда каталитический белок не удавалось полностью отделить от Л/-белка, гидродинамический анализ размеров каталитического белка не проводился. Наименьшие величины его молекулярной массы были получены методом молекулярных мишеней при использовании в качестве субстрата Мп2+-АТФ в мембранах эритроцитов индюка (92 000 дальтон) и печени крыс (150 000 дальтон) [36, 39]. У цитоплазматического каталитического белка из семенников крыс молекулярная масса составляет, по разным данным, от 56000 [22] до 69 000—74000 дальтон [61]. Однако этот белок может отличаться от типичного мембран-носвязанного фермента эукариотических клеток так же, как и иитоплазматическая аденилатциклаза Brevibacterium liguefaci-ens — димерный белок, у которого молекулярная масса мономера, равна 46 000 дальтон [62].

Таким образом, взаимодействие рецептора с yV-белком и N-бел-ка с каталитическим можно зарегистрировать экспериментально. В то же время доказательств взаимодействия рецептора с каталитическим белком не обнаружено. Например, в работе Нойфельда с сотр. [63] было показано, что при гибридизации клеток сус~ или Friend с мембранами эритроцитов индюка разрушение каталитического белка в этих мембранах ацетилтрипсином не сказывалось на переносе в клетки функционирующего р-рецептора.

Несмотря на достигнутые успехи, все же не известен ни субъединичный состав каталитического белка, ни стехиометрия взаимодействия белков аденилатциклазного комплекса в мембране. В начальной стадии находятся исследования химической природы контактов между компонентами аденилатциклазного комплекса.

Исследуя влияние сульфата аммония и других солей на стабильность комплекса N—С в луброльном экстракте мембран мозга [56], Нир и Сальтер пришли к выводу, что взаимодействие Л/-белка с каталитическим имеет преимущественно ионную природу. По-видимому, соли могут сдвигать равновесие N+C^N—С влево в сторону диссоциации комплекса. Гиллон с сотр. установили, что тиол-восстанавливающие агенты уменьшают кажущийся молекулярный размер аденилатциклазы и это также свидетельствует о диссоциации комплекса С—N [57]. В свете этих данных возможно, что SH-группа каталитического белка, впервые обнаруженная Россом с коллегами, существенна не только для проявления ферментативной активности, но и для реализации контакта каталитического белка с VV-белком [8, 64].

Нет ясности в вопросе о том, один и тот же или разные ну-клеотид-связывающие центры jV-белка ответственны за модуляцию сродства рецептора к агонисту и активности каталитического

100

белка. Ряд данных свидетельствует о том, что связующим звеном между рецептором и каталитическим белком является одна и та же популяция N-белков. Так, р-рецептор элюируется вместе с [32Р] АДФ-рибозилированным N-белком, и в то же время степень ковалентной модификации N-белка соответствует степени увеличения чувствительной к ГТФ аденилатциклазной активности [12]. В экспериментах по реконструкции мембран мутантных клеток лимфомы сует и UN С с TV-белком одновременно восстанавливаются чувствительность аденилатциклазы к гормонам и модуляция сродства рецептора к агонистам гуаниловыми нуклеотидами, т. е. две функции, опосредуемые через N-белок, проявляются одновременно [8, 65]. Вельтон с сотр. [66] на основании разделения чувствительной к ГТФ формы рецептора с GppNHp-стиму-лируемой аденилатциклазной активностью предположили существование двух нуклеотид-связывающих центров: модулирующего глюкагоновый рецеп

страница 33
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.08.2019)