198—1201.

13. Chan W. W.-C. (1973) Canad. J. Biochem. 1, 258—260.

14. Chan W. W.-C, Schutt H., Brand K. (1973) Eur. J. Biochem. 40, 533—541.

15. Муронец В. И., Ашмарина Л. И., Наградова Н. К. (1982) Биохимия 47, 977—986.

16. Ashmarina L. I., Muronetz V. I., Nagradova N. К. (1980) Biochem. Intern. 1, 47—54.

17. Hoa gland V. D., Jr., Teller D. C. (1969) Biochemistry 8, 594—602.

18. Ashmarina L. I., Muronetz V. I., Nagradova N. K- (1981) FEBSLett. 128, 22—26.

19. Jurgensen S. R., Wood D. C, Mahler J. C. et al. (1981) J. Biol. Chem. 256, 2383—2386.

20. Andersson L., Mosbach K. (1979) Eur. J. Biochem. 94, 557—563.

21. Muronetz V. I., Zueva V. S., Nagradova N. K. (1979) FEBS Lett.. 107, 277—280.

22. Муронец В. И., Головина Т. О., Наградова Н. К. (1982) Биохимия 47, 3—12.

23. Stallcup W. В., Koshland D. Е., Jr. (1973) J. Mol. Biol. 80, 41—62.

24. Ashmarina L. I., Muronetz V. I., Nagradova N. K. (1982) FEBS Lett. 144, 43—46.

25. Velik S. F., Baggot J. В., Sturtevant J. M. (1971) Biochemistry 10,. 779—786.

26. De Vilder J. J. M., Boers W., Slater E. C. (1978) Biochim. Biophys. Acta 167, 23—34.

27. Velick S. F., Fur fine C. (1963) The Enzymes 7, 243—272.

28. Boyer P. D., Car don I. W. (1982) J. Biol. Chem. 257, 7615—7622.

СТРУКТУРА И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА

Е. А. Перфильева, Т. В. Буларгина, Е. С. Северин

(Биологический факультет МГУ; Всесоюзный научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений, Купавна Московской обл.)

Структурная организация и взаимодействие отдельных компонентов аденилатциклазного комплекса

У высших организмов аденилатциклаза [АТФ-пирофосфатлиаза ^циклизующая), КФ 4.6.1.1] является ферментом плазматических мембран. Вместе с рецепторным и регуляторным белками она образует аденилатциклазный комплекс, который благодаря своей структурной организации способен к тонкой регуляции каталитической активности аденилатциклазы.

Как отмечено в обзоре Росса и Джилмана [1], роль структуры :и состава плазматической мембраны в регуляции активности аденилатциклазы — одна из наиболее туманных и наименее тщательно документированных областей исследования фермента. Основным наблюдением является то, что солюбилизация плазматических мембран или добавление к ним агентов, разрушающих мембранную структуру, вызывают потерю чувствительности к гормону. Хотя описана солюбилизация Мд2+-зависимой аденилатциклазы, регуляторного N-белка и рецепторов, в настоящее время нет работ, в которых бы сообщалось о получении истинно солюбилизиро-ванной гормон-чувствительной активности, которая сохраняла бы специфичность действия гормона. Поэтому, не имея возможности описать исчерпывающим образом работу аденилатциклазного комплекса, в целом, перечислим имеющиеся сведения о структуре, расположении в мембране и взаимодействии его отдельных компонентов.

Показано, что все три белка аденилатциклазного комплекса (рецепторный, регуляторный и каталитический) являются продуктами отдельных генов. Разделение солюбилизированных белковых фракций, несущих связывающую активность р-адренергического рецептора и каталитическую активность аденилатциклазы, осуществлено с помощью гель-фильтрации [2, 3], центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [4] и аффинной хроматографии [5]. Регуляторный белок, обозначаемый разными исследователями как G-белок, G, N, G/F. или белок, связывающий гуаниловые нуклеотиды, достаточно полно отделили от каталитического, ис-лользуя свойство Af-белка связываться с ГТФ-агарозой. После

*4

' элюции Л'-белка с аффинной матрицы гуаниловыми нуклеотидами его можно было вновь реконструировать с каталитическим белком [6, 7]. Росс с сотр., используя различия в чувствительности регуляторного и каталитического компонентов к нагреванию и к обработке Л^-этилмалеимидом, выборочно инактивировали каталитический белок в экстрактах плазматических мембран различных клеток. Полученные таким образом препараты N-белка затем использовали для встраивания в мембраны сус--клеток], и это приводило к восстановлению регуляторных свойств аденилатциклазы [8]. Полное разделение JV-белка и каталитического белка с сохранением их активностей достигнуто гель-хроматографией натрий-холатных экстрактов мембран печени и мозга в растворах высокой ионной силы [9, 10].

р-рецептор ретикулоцитов крыс, связанный с меченым антагонистом, также отделяли гель-фильтрацией отЛ^-белка, моченного i2P' в катализируемой холерным токсином реакции АДФ-рибозилиро-¦ания [12]. И наконец, из печени кролика [13, 14] и эритроцитов» индюка [15] в лаборатории Джилмана в высокоочищенном виде-получены препараты Af-белка, свободные от примесей рецепторов или каталитического белка.

Все составные части аденилатциклазного комплекса являются интегральными белками мембран. Они имеют на своей поверхности гидрофобные участки, о чем свидетельствует связывание этих: белков с неионными детергентами. В результате гидродинамических исследований детергентных экстрактов мембран было показано, что N-белок имеет сравнительно небольшую гидрофобную зону, так как ои связывает меньшее количество детергента [16и 17], чем каталитический [4, 18] или рецепторный белок [4]. В эритроцитах человека JV-белок обнаруживается на внутренней поверхности плазматической мембраны [19], однако какая-то-часть его все же связана с липидным бислоем, так как селективные агенты, высвобождающие из мембран неинтегральные белки,, не способны полностью солюбилизировать N-белок [16, 20]. Кас-лов с сотр. предполагают, что N-белок имеет вытянутую форму и пронизывает мембрану таким образом, что его гидрофобный участок связывается с липидным бислоем, тогда как гидрофильная часть экспонирована в цитоплазму [16]. О прочной связи с бислоем каталитического и рецепторного белков может свидетельствовать тот факт, что хорошая реконструкция стимулируемой катехоламинами аденилатциклазной активности происходит только в тех случаях, когда в солюбилизированном виде находится Af-белок, а каталитический белок и рецептор встроены в мембра-ну [8].

Следует отметить, что, в отличие от гидрофобного каталити-

1 Клетки сус~ — генетический вариант клеток мышиной лимфомы S49, содержащий в мембранах нормальный 6-рецептор и каталитический белок аденилатциклазы, лишенный чувствительности к гормонам и к гуаниловым нуклеоти-дам. Эти клетки не содержат белковых субстратов для катализируемого холерным токсином АДФ-рибозилирования [II].

9?

"ческого белка, обнаруживаемого в мозге быка и в клетках лим-•фомы 549 [4, 18], каталитический белок из мембран почек и семенников крыс почти не связывает детергента [21, 22]. Кроме того, в семенниках крыс и в сперме быка обнаружена цитоплазматиче-ская форма аденилатциклазы [22, 23]. Возможно, что эти различающиеся по гидрофобности и молекулярным размерам формы ¦фермента являются продуктами разных генов или же результатом протеолиза или дифференциальной солюбилизации различных субъединиц аденилатциклазы.

Для определения молекулярных размеров белков аденилатци-клазной системы