с НАДН в указанных на рис. 3 концентрациях и с субстратами обоих ферментов. НАДН окислялся лактатдегидрогеназой, и образующийся НАД использовался в глицераль-дегид - 3 - фосфатдегидрогеназной реакции. После завершения реакции инкубационную смесь отделяли от иммобилизованных фер-

40 50 60 [ШДН],мкП

Рис. 3. Зависимость удельной ак тивности иммобилизованных моно меров (/) и тетрамеров (2) гли-

церальдегид-З - фосфатдегидроге- ментов фильтрованием и опреде назы от концентрации кофактора г

v ^ ляли активность глицеральдегид-

3- фосфатдегидрогеназы по убыли субстрата. Результаты опытов, приведенные на рис. 3, показывают, что при крайне низких концентрациях кофактора, близких к концентрации ферментов, активностью обладают только тетра-мерные формы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, а мономер полностью неактивен. Вероятно, сродство к кофактору у мономера значительно ниже, чем у тетрамера, и неспособность связать НАД

90

не позволяет ему осуществить катализ. Иная картина наблюдается при концентрациях кофактора 20—60 мкМ, так как в этом ,-случае мономер не только обладает активностью, но и катализирует реакцию в 1,5—2,0 раза более эффективно, чем тетрамер. Мы полагаем, что большая каталитическая эффективность мономера в этом случае обусловлена его меньшим сродством к кофакторам: поскольку фосфоролиз ацил-фермента невозможен без отщепления НАДН, облегчение последнего процесса должно приводить к ускорению реакции. При невысоких концентрациях НАД в среде отщепление НАДН от фермента и его замена на НАД -более эффективно могут осуществляться на мономерах, обладающих меньшим сродством к кофакторам. При избытке НАД вытеснение НАДН из моно- и тетрамеров происходит одинаково эффективно, и отличий в их активности обнаружить не удается. Вероятно, в данном случае основным преимуществом тетрамерной структуры является более прочное связывание кофактора и, как следствие, меньшая зависимость каталитической активности фермента от концентрации НАД в среде.

Несколько иная ситуация была обнаружена нами при сравнении свойств иммобилизованных моно- и тетрамеров глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика. Для этого •фермента характерна выраженная отрицательная кооперативность по связыванию НАД: первая молекула НАД связывается с тет-рамером мышечной дегидрогеназы с Kd Ю-11—10~8 М (по данным разных авторов и при определении различными методами), а последняя, четвертая молекула НАД — с Kd Ю-5 М [25, 26]. Величина Кт для этого фермента в отношении НАД близка к значению последней константы — 1—5-Ю-5 М [27]. По последним данным Бойера [28], катализ происходит именно в тех активных центрах, которые содержат прочносвязанный НАД, а после образования ацил-фермента в этих центрах наступают конформационные изменения, приводящие к увеличению сродства в активном центре соседней субъединицы. Вероятно, причиной расхождений в величинах Kd и Кт являются постоянные конформационные изменения, приводящие к изменению сродства к кофакторам в ходе катализа и влияющие на скорость лимитирующих катализ стадий.

Указанные выводы были сделаны при исследовании тетрамеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из мышц, а какая ситуация наблюдается для мономерных форм? Определение величин Кт для иммобилизованных тетрамеров и мономеров дегидрогеназы показывает, что в отношении НАД они значительно отличаются: соответственно 0,077±0,002 и 0,025+0,003 мМ. Для 3-фосфоглицеринового альдегида Кт одинаковы и равны 0,2 мМ. Причиной отличий может быть увеличение сродства к кофактору у мономерной формы и, следовательно, снижение Kd- Однако нами было показано, что при добавлении 50-кратного молярного избытка НАД к препарату иммобилизованных мономеров после 10-минутной инкубации и последующего отмывания избытка кофактора не происходит его связывания с мономерами, тогда как с иммо-

91

билизованными тетрамерами НАД связывается при добавлении в эквимолярной количестве. Таким образом, в иммобилизованных мономерах глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика сродство к кофактору значительно снижается, а Кт уменьшается. Это приводит к сближению величин Кт и Kd для кофактора, которые у исходных тетрамеров отличаются на 3— 5 порядков.

По-видимому, биологический смысл образования четвертичной структуры с кооперативными взаимодействиями между активными центрами в данном случае и заключается в создании фермента, обладающего сильно отличающимися значениями Кт и Kd Для кофактора. Такая особенность позволяет, с одной стороны, крайне прочно связывать кофактор в двух из четырех активных центров,, что обеспечивает эффективную конкуренцию за НАД с другими дегидрогеназами и высокую стабильность молекулы фермента, а с другой — эффективно осуществлять катализ (практически так же, как и в мономерной форме). Кооперативные взаимодействия между субъединицами позволяют создать ферментативную систему, в минимальной степени зависящую от концентрации НАД. Учитывая, что глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа катализирует центральную стадию гликолиза, на которой возникает первое макроэрги-ческое соединение, а НАД эффективно используется в целом ряде конкурирующих процессов, указанный механизм должен играть важную роль в обеспечении эффективного функционирования энергетического обмена.

Из результатов работ по получению и исследованию свойств иммобилизованных мономеров НАД-зависимых дегидрогеназ можно прийти к однозначному выводу, что для осуществления каталитического акта объединение субъединиц не является обязательным. Однако, как следует из опытов с глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназон, возникновение четвертичной структуры создает предпосылки для совершенно иной регуляции протекания каталитического акта и делает его оптимально приспособленным для выполнения функции фермента. Возможно, последующие исследования моно- и олигомерных форм НАД-зависимых дегидрогеназ позволят обнаружить и другие случаи такого рода «приспособительных» изменений свойств фермента при возникновении олиго-мерной структуры.

ЛИТЕРАТУРА

1. П о л я н о в с к и й О. Л. (1971) Четвертичная структура и аллостерическче свойства ферментов. В кн.: Биологическая химия, Изд-во ВИНИТИ, М., 6—56.

2. Rudolph R., Heider I., Jaenicke R. (1977) Eur. J. Biochem., 81, 563—570.

3. Jaenicke R., Vogel W., Rudolph R. (1981) Eur. J. Biochem. 114, 525—531.

4. Stallcup W. В., Koshland D. E., Jr. (1973) J. Mol. Biol. 80. 77—91. 92

5. Hermann R., Rudolph R., Jaenicke R. (1979) Nature, 277, 243—245. " 6. Cho I. C, Swaisgood H. E. (1972) Biochem. Biophys. Acta 258„ 675—679.

7. Cho I. C, Swaisgood H. E. (1974) Biochem. Biophys. Acta. 334„ 243—256.

8. Chan W. W.-C, Mosbach K. (1976) Biochemistry 15, 4215—4222.

9. Муронец В. И., Чередникова Т. В., Наградова Н. К. (1981) Биохимия 46, 1731 — 1739.

10. Nagradova N. К., Golovina Т. О., Mevkh А. Т. (1974) FEBS Lett. 49, 242—245.

11. Ashmarina L. I., Muronetz V. I., Nagradova N. K. (1982) Biochem. Intern. 3, 415—423.

12. Chan W. W.-C. (1970) Biochem. Biophys. Res. Com. 41, 1