Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

фермента падала до 23%; после отфильтровывания и промывки иммболизованного фермента буферным раствором его активность увеличивалась и составляла 70% от исходной.

8

Из этих данных следует, что взаимодействие PGH-синтетазы с индометацином имеет обратимый характер.

2. Кинетические измерения показали, что схема взаимодействия PGH-синтетазы с индометацином имеет вид

E+IT^EI. (3) fc_i

Кинетические кривые изменения активности PGH-синтетазы в процессе инкубации фермента с индометацином приведены на рис. 4. Видно, что даже при длительном времени инкубации активность фермента не падает до нуля, а достигает некоторого предельного значения, зависящего От концентрации ингибитора.

Рассмотрим особенности кинетики процесса для обоих этих случаев. Для необратимой инактивации в условиях соизмеримости /0 и Ео справедливо соотношение

/о(Е0-Е/)

При ?о>/о (условие сохранения остаточной активности фермента при бесконечном времени) и t-*- имеют место условия:. ?о///о?->-0 или /-»-0. Для них концентрация соединения El цри бесконечном времени равна /о. Из уравнения материального баланса следует

ЕЖ=Е0~10, или -^ = 1--(5)

Се со

где Ео, — остаточная предельная концентрация фермента. И?е-соотношения (5) при пропорциональности активности концентрации фермента следует, что для случая необратимой инактивации в условиях 1о~Е0 относительная активность фермента должна линейно падать с ростом концентрации ингибитора.

Зависимость предельной относительной активности от концентрации ингибитора приведена иа рис. 46. Видно, что уравнение (5J (пунктирная линия) не описывает существующей зависимости.

Кинетические данные согласуются со схемой (3), согласно которой индометацин представляет собой медленный обратимый ингибитор PGH-синтетазы. В соответствии с этой схемой изменение концентрации комплекса фермент—ингибитор во времени должно быть представлено уравнением

Ш = Wo Г j _ g-< Vo+fc.,)^ (6)

а относительное изменение активности уравнением

A, Vq-Hli 1 w

Соответствие экспериментальных данных уравнению (7) иллюстрирует рис. 5. Зависимость обратного наблюдаемого характерно-

9

тического времени представлена линейной функцией концентрации ингибитора, из которой следуют константы скорости прямой и обратной реакции и соответственно константа равновесия образования комплекса.

8 мин

» Рис. 5. Кинетические характеристики ингибирования PGH-синтетазы индометацином. а — линеаризация данных рис. 4 а по ингпбированию PGH-синтетазы индометацином ¦ в координатах уравнения (7); концентрации ингибитора (мкМ): / — 1,4; 2 — 2,2;

'«? — 3,8; 4 — 5,4; б — зависимость наблюдаемой константы скорости инактивации первого порядка от. .концентрации индометацина; Л<»— активность фермента при длительном (бесконечно большом) времени инкубации с ингибитором

А/А,

ьо-

0,1

20

40

60

мин

Рис. 6. Изменение во времени активности PGH-^мштетазы при инкубации фермента (микросомная фракция везикулярных желез) с

бутадиеном (мМ). / — 0,62; 2 — 3,4; 3 — 4,2. Условия: 32°С, рН 7,2, 20 мМ фосфат, 1,6% этанола, 0,1% твин-20

Совершенно аналогично индометацину ведет себя в реакции ингибирования PGH-синтетазы вольтарен. Кинетические кривые падения активности фермента при различных концентрациях воль-тарена подобны приведенным на рис. 4а. Они так же спрямляются в рамках-координат уравнения (7), давая зависимость обратного характеристического времени от концентрации ингибитора, из которой могут быть найдены константы скорости прямой и обратной реакций взаимодействия вольтарена с активным центром фермента.

Индометацин и вольтарен относительно медленно взаимодействуют с активным центром PGH-синтетазы. Процесс установления равновесия занимает более 10 мин. Если в реакционную смесь для измерения активности фермента вводить равновесную реакционную смесь фермент — ингибитор, по детектируемой активности можно «оттитровать» находящийся в растворе свободный фермент.

10

При этом из зависимости скорости реакции от концентрации субстрата при различных концентрациях ингибитора можно было бы наблюдать кажущийся эффект неконкурентного ингибирования (влияние концентрации ингибитора на максимальную скорость при постоянном значении наблюдаемой константы Михаэлиса). В реакции ингибирования PGH-синтетазы индометацином такой 'кажущийся эффект неконкурентного ингибирования действительно имеет место. В раствор PGH-синтетазы вводили индометацин в различных концентрациях, смесь фермента с ингибитором инкубировали около часа для установления равновесия, «замораживали» равновесие понижением температуры до 4°С, после чего изучали зависимости скорости от концентрации арахидоновой кислоты, вводя в реакционную ячейку смесь фермента с ингибитором. Действительно, наблюдаемые закономерности формально эквивалентны случаю неконкурентного ингибирования. Однако смысл этой зависимости для системы индометацин — PGH-синтетаза совершенно отличен от смысла механизма классического неконкурентного ингибирования. В обсуждаемой системе ингибитор блокирует часть активных центров фермента, при этом, естественно, характеристики свободной формы фермента, такие, как наблюдаемая константа Михаэлиса, остаются без изменения.

Бруфен, напроксен, бутадион, анальгин — быстрые, обратимые ингибиторы PGH-синтетазы

Исследование ряда других нестероидных противовоспалительных препаратов показало, что они являются быстродействующими и обратимыми ингибиторами исследуемого фермента. При добавлении их к раствору фермента можно наблюдать быстрое подавление активности катализатора, которое постоянно во времени (см., например, рис. 6). Изучение этого класса ингибиторов было проведено в рамках известных подходов к исследованию влияния их на скорость ферментативной реакции в присутствии субстратов [26].

Были исследованы зависимости скорости реакции от концентрации субстратов при различных концентрациях ингибиторов. Как известно, в реакции, катализируемой PGH-синтетазой, принимают участие следующие субстраты: арахидоновая кислота, кислород и восстановитель — донор электронов '[27]. Зависимости скорости реакции от концентрации арахидоновой кислоты и адреналина при различных концентрациях бруфена приведены на рис. 7. Эти же зависимости для напроксена аналогичны. Бутадион и анальгин также являются обратимыми ингибиторами PGH-синтетазы, однако эффективность ингибирования бутадионом и анальгином несколько ниже, чем бруфеном и напроксеном.

С формально кинетической точки зрения указанные ингибиторы (бруфен, напроксен, бутадион, анальгин) выступают в качестве конкурентных ингибиторов по отношению к арахидоновой кислоте и в качестве бесконкурентных ингибиторов по отношению

11

к донору электронов. Эти эффекты ингибирования для случая многосубстратной реакции потребовали специального рассмотрения.

1/0-,(МкМ^/миНМГ)

-t

8

12 16 1/[АА1,мМ

6

12 т

Рис. 7. Зависимость скорости PGH-синтетазной реакции (микросомная фракция

везикулярных желез) от концентрации арахидоновой кислоты (а) и адреналина (б) в обратных координатах пр

страница 3
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)