Bromstrom С. O. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 4108—4117.

158. Potter J. D., Gergely J. (1975) J. Biol. Chem. 250, 4628—4633.

159. King M., Carlson G. M. (1981) Arch. Biochem. Biophys. 29, 517—523.

160. King M., Carlson G. M. (1981) J. Biol. Chem. 256, 11058—11064.

161. Clerch L. В., Huijing F. (1972) Biochem. Biophys. Acta 268, 654—662.

162. Singh T. J., Acatsuka A., Huang K-P. (1982) Arch. Biochem. Biophys. 218, 360—368.

163. Perry S. V. (1974) Biochem. Soc. Symp. 39, 115—132.

164. Vagi K., Jakawa M., Kakiuchi S. et al. (1978) J. Biol. Chem. 253, 1338—1340.

165. Dedman J. R., Potter J. D., Means A. R. (1977) J. Biol. Chem. 252, 2437—2440.

166. Danforth W., Heilmreich E. (1964) J. Biol. Chem. 239, 3133—3138.

167. Danforth W., Lyon J. B. (1964) J. Biol. Chem. 239, 4047—4050.

168. Posner J. В., Krebs E. G. (1965) J. .Biol. Chem. 240, 982—985.

169. Drummond G. I., Harwood J. P., Powell C. A. (1969) J. Biol. Chem. 244, 4235—4240.

АКТИВНЫ ЛИ СУБЪЕДИНИЦЫ НАД-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ!

В. И. Муронец

(Межфакультетская проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского МГУ)

НАД-зависимые дегидрогеназы представляют собой довольно обширный класс ферментов, важной особенностью строения которых является наличие четвертичной структуры. Нативная молекула НАД-зависимых дегидрогеназ состоит из нескольких (от двух до восьми) идентичных субъединиц, причем каждая из них формирует свой собственный активный центр. При исследовании таких ферментов.возникает естественный вопрос — зачем же нужна оли'-гомерная структура, если активный центр образуется без ее участия? Одна из функций четвертичной структуры — стабилизация белковой глобулы за счет образования общего гидрофобного ядра — была известна достаточно давно и не вызывала сомнений • (например [1]). В отношении же роли ассоциации субъединиц в катализе и регуляции ферментативной активности долгое время сохранялись весьма неопределенные представления. С одной стороны, в каждой субъединице олигомера дегидрогеназ были все предпосылки для осуществления каталитического акта, а с другой — при проведении опытов в растворе накапливалось все большее количество данных об отсутствии активности у мономерных форм и о необходимости их ассоциации для появления активной молекулы фермента [2, 3]. Эти данные, а также факт существования кооперативных взаимодействий между субъединицами (что характерно для большинства дегидрогеназ) позволили ряду исследователей предложить следующую концепцию: катализ возможен только при объединении нескольких субъединиц, поскольку для полного протекания реакции в активном центре одной субъединицы необходимы определенные изменения в сопряженном с ним активном центре другой субъединицы. Например, в случае глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.12) фосфоролиз ацилфермента с образованием продукта реакции (а возможно, и отщепление НАДН) в активном центре одной субъединицы происходит только при связывании субстрата в соседней субъединице [4]. Сущность описанного механизма (получившего название «флип-флоп») заключается как бы во взаимопомощи двух активных центров, способствующей протеканию ферментативной реакции.

Не отрицая важности такого механизма реакции в условиях, близких к естественным (ненасыщающие концентрации кофакто-

80

jpoB и субстратов), мы полагали, однако, что взаимодействия субъ-Уёдиниц в катализе должны иметь минимальное значение при определении активности олигомерных ферментов в обычных экспериментальных условиях — при избытке кофакторов и субстратов, кратковременном измерении активности (до начала ингибирования реакции ее продуктами). В этом случае активностью моглш обладать не только олигомерные, но и мономерные формы дегидрогеназ. Причиной же инактивации ферментов-олигомеров при их диссоциации в растворе мог быть не распад на субъединицы, а. быстрая денатурация мономеров, обусловленная их нестабильностью в отсутствие контактов с соседними полипептидными цепями. К сожалению, многочисленные эксперименты по денатурации и реактивации различных НАД-зависимых дегидрогеназ, проведенные в растворе, не давали однозначного ответа на вопрос о пер-сопричине потери мономерами ферментативной активности [2, 3,. 5]. Факты инактивации мономеров при диссоциации исходных, форм дегидрогеназ не вызывают сомнений, но установить на основании только кинетических данных, чем вызвана инактивация — собственно распадом на субъединицы или конформационными изменениями последних — на наш взгляд, практически невозможно.

Для исследования вопроса о каталитической активности мономерных форм НАД-зависимых дегидрогеназ мы прибегли к методу4 иммобилизации олигомеров этих ферментов на нерастворимом' носителе — в нашем случае сефарозе 4В. Иммобилизация должнаг. была бы предотвратить реассоциацию мономеров дегидрогеназ, а. также, по нашим предположениям, оказать на мономеры стабилизирующее действие и, следовательно, помешать их инактивации.. До начала нашей работы в литературе имелись противоречивые сведения о свойствах иммобилизованных мономеров одной из НАД-зависимых дегидрогеназ — лактатдегидрогеназы. В одной работе, были получены иммобилизованные ковалентно на пористом стекле-мономеры лактатдегидрогеназы, обладающие довольно низкой удельной активностью [6, 7], а в другой — полностью неактивные мономеры [8]. Мы изучали каталитические свойства иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из двух различных источников, а также мономеров лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27).

Особенности иммобилизации олигомерных ферментов, используемых для получения связанных с матрицей субъединиц

Препараты иммобилизованных ферментов-олигомеров, которые используются для получения ковалентно связанных с матрицей мономерных форм, должны удовлетворять некоторым требованиям. Во-первых, олигомерная молекула белка должна быть связана с носителем только через одну из субъединиц, так как в противном случае невозможно будет получить иммобилизованные моно-

81

мерные формы. Во-вторых, необходимо иметь точную информацию о том, из скольких субъединиц состоит иммобилизованный олигомер. Без таких сведений трудно интерпретировать данные по диссоциации: например, снижение содержания белка на матрице в 2 раза может быть следствием диссоциации тетрамера на димеры или димера на мономеры.

Приведенные в табл. 1 данные показывают, как зависит характер присоединения тетрамерной молекулы глицеральдегид-3--фосфатдегидрогеназы к сефароэе 4В от количества добавленного для активации носителя бромциана. Для определения числа субъединиц фермента, вовлеченных в ковалентное связывание с носителем, мы использовали жесткую обработку препаратов дегидрогеназы 8М мочевиной в течение 3—16 ч [9]. Из данных таблицы видно, что с увеличением степени активации возрастает число субъединиц, ковалентно связанных с матрицей, и одновременно снижается удельная активность фермента. При концентрациях

BrCN ниже 10 мг/мл уплотненного центрифугированием геля сефарозы фермент связы