ной КФ лаг-стадия. Если активность определяли при рН 8,2 или предварительно активировали фер-

71

мент самофосфорилированием, то никакой активации металлами не обнаруживали. Синергизм действия Са2+ и Mg2+ оказывал влияние на кинетические характеристики фермента.

Как мы уже отмечали, разные формы КФ сильно отличаются -по сродству к Са2+ [9, 19]. Концентрация Са2+ для полумаксимальной активации (C0i5) неактивированной КФ при рН 6,8 и 8,2 •соответственно равна 23 и 16 мкМ [19]. Эти величины на порядок выше, чем найденные в более ранней работе [9]. Но при •активации фермента фосфорилированием или путем ограниченного протеолиза величина С0,5 значительно уменьшалась. Связано •ли это с повышением сродства 6-субъединицы к металлу или с -каким-то другим механизмом, пока не ясно. Можно, например, предположить, что Са2+-связывающие центры настолько высоко дифференцированы, что в зависимости от формы фермента присоединяется меньшее или большее число молекул Са2+. Однако •экспериментальных доказательств для такого предположения пока •не существует.

В настоящее время еще нет достаточной ясности относительно ¦взаимодействия КФ с ионами Mg2+. Помимо того что уже было описано выше, можно отметить участие его в образовании комплекса КФ с гликогеном [47], а также участие в катализируемой киназой реакции путем образования комплекса Mg-АТФ [3]. Однако характер влияния свободного Mg2+ на ферментативную активность является спорным. Имеющиеся сведения довольно противоречивы. Клерх и др. [161] нашли стимулирующий эффект свободного Mg2+ на активность неактивированной КФ в условиях насыщающей концентрации Mg2+-ATФ, постоянной концентрации, .АТФ и варьирующей концентрации Mg2+. Известны, однако, и другие данные, показавшие, что в зависимости от концентрации .металла проявлялось активирующее или ингибирующее действие •[162]. Более детальное выяснение роли Mg2+ в механизмах регуляции активности фермента, безусловно, представляет большой интерес для дальнейших исследований.

Значение Са2+ состоит не только в том, что он непосредственно активирует КФ, но и влияет на некоторые белки, КМ и тропонин С, превращая их в активаторы фермента.

Активация КФ добавленным КМ была обнаружена почти одновременно в двух разных лабораториях [18, 111]. Она была обусловлена связыванием в присутствии Са2+ второй молекулы КМ (б'-субъединицы) со вторым КМ-связывающим центром на молекуле фермента. Опыты, в которых совместно с КМ и Са2+ добавляли антипсихотропный агент — трифлуороперазин или тропонин I, специфически связывающие КМ, демонстрировали полное отсутствие активации КФ, при этом наблюдалось сохранение зависимости ферментативной активности от Са2+ [16, 18]. Существование второго центра для связывания КМ было обнаружено также при •взаимодействии КФ с кальмодулин-сефарозой 4В в присутствии ионов Са2+. Связавшийся фермент отделялся от сорбента элюиру-ющим буфером, содержащим ЭГТА [18, 111]. Все эти данные

72

указывали, что б'-субъединица не прочно связывалась с ферментом и при удалении Са2+ диссоциировала. Степень активации фермента КМ сильно варьировала от 1,5 до 8 раз, какой-либо закономерности в зависимости от определения активности при рН 6,8 или 8,2 не было обнаружено [16, 18, 111, 150]. КФ, обработанная трипсином, теряла способность активироваться КМ и связываться с кальмодулин-сефарозой 4 В [111].

Вскоре было замечено, что препараты КФ, которые могли активироваться КМ в присутствии Са2+, обладали способностью в той же степени активироваться тропонином С, частично сходным с КМ по первичной структуре, а также по Са2+-связывающим свойствам. Так как при совместном добавлении КМ и тропонина С не наблюдалось суммарного эффекта на активацию КФ, можно было считать, что они конкурируют за один и тот же центр на ферменте [17, 18]. Концентрация КМ для полумаксимальной активации КФ равна 9 нМ [19] или 15 нМ [16], в то время как для такой же активации фермента тропонином С или тропонино-вым комплексом требовалось в 100—200 раз более высокая концентрация. Тем не менее по целому ряду причин этот факт заслуживал большего внимания. Во-первых, тропонин С, требовавшийся для полумаксимальной активации КФ, добавлялся в микромолярных количествах (36 мкМ/мл) [17]. Учитывая соотношение концентраций в мышцах: тропонина — 100 мкМ [163] и КФ 2,5 мкМ [24], с одной стороны, и КМ — 6 мкМ {18] — с другой, можно полагать, что такое большое количество тропонина в мышечной клетке вполне достаточно и для взаимодействия с тро-понин-тропомиозиновым комплексом и для .активации КФ- В то же время имеющееся количество КМ, 40% которого уже связано в комплексе с киназой (б-субъединица), должно использоваться также для активации других белков, например киназы легких цепей миозина [164]. Во-вторых, важным обстоятельством служит связь тропонина С — одного из компонентов тропонин-тропомио-зинового комплекса — с тонкими мышечными волокнами, связанными в присутствии Са2+ с гликогеновыми частицами, содержащими ферменты обмена гликогена [17].

Таким образом, если допустить возможность активации КФ тропонином С, а также актином — основным структурным белком тонких мышечных волокон, как было показано в работе Погла-зова и др. [136, 137], то следует признать, что эти явления могут лежать в основе механизма сопряжения мышечного сокращения и гликогенолиза, в регуляции которого ключевую роль играет КФ.

В пользу этой гипотезы можно упомянуть данные о специфичности активирующего действия тропонина С, который не влияет на активность киназы легких цепей миозина и на фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов даже при концентрации в 1000 раз более высокой, чем та, которая требовалась для активации КФ [165]. Может быть, с этим же связан и тот факт, что сердечный тропонин С не активировал мышечную КФ [19].

В этой связи следует также отметить, что, по мнению Коэна,

тропонин С специфически активирует нефосфорилированную форму КФ. Несмотря на то что активность фосфорилированной формы фермента полностью зависит от Са2+, она лишь незначительно активируется тропонином. По-видимому, при гормональной активации фермента путем фосфорилирования цАМФ-зависимой протеинкиназой функцию Са2+-зависимой регуляции выполняет б-субъединица, входящая в состав молекулы КФ.

Основываясь на результатах анализа скорости образования ФА при электрическом раздражении изолированной мышцы лягушки и кошки [166, 167], зависимой от частоты электрической стимуляции, позволяющей создать условия, при которых скорость образования ФА увеличивается в 100 раз, Коэн высказал предположение, что при такой ситуации активация КФ тропонином является специфической. Дело в том, что в указанных условиях сокращение мышцы происходило в отсутствие адреналина, и поэтому как в покоящейся, так и в возбужденной мышце КФ находилась в неактивированном состоянии, т. е. была неактивной при рН 6,8 [168, 169]. Следовательно, КФ не могла обеспечить быстрое образование ФА в присутствии Са.2*, если бы она не активировалась тропонином С.

нервный импульс

Са

2+

.кальмодулин

активированная киназа фосфорилазы

ин