Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

твительностью фермента к протеолизу, образование разных форм КФ, активность которых в большей или меньшей степени зависит от Са2+, связано, возможно, с действием тканевых протеиназ. Но в литературе отсутствуют какие-либо сведения, подтверждающие это предположение. По данным Коэна [19], концентрация Са2+ для полумаксимальной активации даже при незначительной деградации КФ трипсином равна 0,05 и 0,07 мкМ соответственно при рН 8,2 и 6,8, что в 300 раз ниже, чем для неактивированной КФ. После протеолиза КФ трипсином [14] ее активность и активность выделенных из неактивированной киназы комплексов уб и ссуб на 25—30% проявлялась в отсутствие Са2+ [59, 120], а низкомолекулярный фрагмент, полученный после протеолиза КФ субтилизином, вообще не требовал для своей активности добавления металла (см. рис. 2) [34].

После того как в составе КФ был открыт термостабильный компонент, активирующий фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов в присутствии Са2+, и было установлено, что этот белок, сходный по своим свойствам с КМ, является четвертой б-субъеди-ницей фермента [49, 149], появились новые работы, уделившие большое внимание детальному анализу Са2+-связывающих свойств изолированной б-субъединицы и в составе комплекса с КФ.

Известно, что КМ широко распространен в животных тканях и, являясь основным цитоплазматический рецептором Са2+, уча-

69

ствует в регуляции ферментов обмена гликогена и сократительных белков мышц. Связывание КМ с различными белками происходит при физиологической концентрации Са2+, а в отсутствие металла КМ отделяется от белков и находится в свободном состоянии. Среди известных ферментов, зависимых от КМ и от Са2"1-, КФ является единственным, содержащим прочносвязанный КМ (б-субъединицу), который не отделяется даже при обработке 8 М мочевиной при полном отсутствии Са2+ [122]. Количество КМ, связанное в комплексе с субъединицами КФ, составляет около половины всего белка, имеющегося в мышцах [18, 24, 150]. В настоящее время вполне обоснованным можно считать мнение о том, что в молекуле КФ б-субъединица является ответственной за связывание Са^ [24, 151]. Теперь, когда стала известна функция 6-субъединицы, можно было оценить кинетические свойства Са^-связывающих центров, используя различные экспериментальные условия и методические приемы, как гель-фильтрацию, равновесный диализ, электрометрическое титрование, метод абсорбционной спектрофотометрии [19, 151—156]. Как и другие Са2+-связывающие белки, КМ и тропонин С, б-субъединица характеризовалась наличием Са2+-связывающих центров, обладающих различным сродством к металлу [9, 151—153]. Исследуя кинетику связывания Са2+ с КФ в р-глицерофосфатном буфере (рН 6,8), Килиманн и др. [152] нашли, что в этих условиях на молекулу фермента (абу6)4 связывалось 12 Са^ с величиной константы диссоциации (Kd), равной 1.5ХЮ-8 М, и 4 Са2* с Kd= = 6х10~7 М. Так как КМ связывал 4 Са2* на моль, то эти данные позволили считать, что центры связывания металла в молекуле КФ локализованы на б-субъединице. При измерении констант диссоциации оказалось, что в молекуле КМ три Са^ имели Kd= = 2ХЮ-7 М и один Са2+ — Kd^XKH М [157, 158]. Сравнение величин констант диссоциации комплексов КФ с Са24- и КМ с Са2+ показывает, что б-субъединица, входящая в структуру молекулы фермента, связывается с Са прочнее, чем свободный КМ.

Последующий анализ Са2+-связывающих свойств субъединицы, проведенный в условиях различной ионной силы и в зависимости от присутствия ионов Mg2+, позволил дифференцировать шесть центров связывания металлов в расчете на офуб: два — Ca2+/Mg2+, два центра Са^-специфических и два центра Mg2+-cпeцифичecкиx [154]. Ранее аналогичные центры были определены в тропонине С [158]. Добавление Mg2+ оказывало влияние не только на Са^-связывающие свойства 6-субъединицы КФ, но и на число мест связывания металла [152—155]. Этот эффект Mg^ имеющий, возможно, аллостерическую природу, был связан с хорошо выраженными конформационными изменениями белка, в результате которых открывались дополнительные центры связывания Са2+ [151, 152]. Следует отметить, что tAg2* оказывал более сильное влияние на сродство Са2+ к Са2+-специфическим центрам холофермен-та, чем изолированной б-субъединицы [151, 154]. При совместном присутствии металлов наблюдалась конкуренция за центры с вы-

70

соким сродством и это сопровождалось уменьшением константы диссоциации Са2+ по отношению к Са2+-специфическим центрам. Взаимодействие КФ с Са24" в присутствии обоих металлов чрезвычайно сильно отражалось на изменении тирозиновой флуоресценции, свидетельствовавшем о влиянии металлов на конформа-ционное состояние белка [154].

Таким образом, исследование Са2+-связывающих свойств холофермента и выделенной из него б-субъединицы хорошо демонстрировало значение четвертичной структуры фермента в регуляции его ионами Са2+. По-видимому, на связывание Са2+ с 6-субъ-единицей оказывает влияние не только прочносвязанная с ней у-субъединица [122], но и другие, а- и р-субъединицы, в отсутствие которых комплекс уб лишь частично проявляет свою активность без добавления Са2+ [120, 121].

В ряде работ была изучена зависимость между скоростью связывания Са2+ и изменением ферментативной активности КФ. Повышение активности нефосфорилированной КФ отчетливо коррелировало в работе Бугера и др. [151] со связыванием трех молекул Са2+ в расчете на офуб; одна из них имела более высокое сродство (/Cd=0,31 мкМ), чем две другие (/Сд=2,15 мкМ). Влияние четвертой молекулы Са2+ авторам определить не удалось, так как в используемых ими экспериментальных условиях при концентрации Са2+ 100 мкМ фермент выпадал в осадок.

Весьма сложная зависимость между активацией фермента и связыванием металлов была выявлена в присутствии Са2+ и Mg2+ [155, 156]. На основе полученных данных авторы пытались дифференцировать центры связывания металлов, ответственные за специфичность фермента, используя в качестве субстратов ФБ, тропонин и собственную молекулу фермента, а также центры, ответственные за активность КФ при различных значениях рН. В зависимости от условий эксперимента (рН, ионной силы и концентрации металлов) рассматривались три типа активности: Ло, А\ и Ач- Первый тип активности — Л0, — независимый от Са24" составлял незначительную часть общей активности и выявлялся при очень низкой концентрации Са2+. При связывании Са2+ в Ca2+/Mg2+-ueHTpax, характеризующихся высоким сродством к Са2+, проявлялась активность А\. Вторая стадия активации фермента, связанная с активностью А%, происходила, когда были заняты Са2+-специфические центры, индуцированные в присутствии высокой концентрации Mg2*- [155].

О существенном значении Mg2+ для Са24>зависимой регуляции активности КФ можно судить также на основании результатов определения ферментативной активности при рН 6,8 после предынкубации неактивированной КФ с металлами [159, 160]. Короткая инкубация (1,5 мин) с одним из металлов не влияла на активность, в то время как при их совместном добавлении активность при рН 6,8 возрастала в 7 раз, при этом исчезала характерная для неактивирован

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.11.2019)