ингибирования фермента этим соединением [24]. В дальнейшем было проведено исследование механизмов ингибирования PGH-синтетазы нестероидными противовоспалительными средствами \[25]. В рамках поставленной проблемы решались следующие связанные между собой задачи.'

1. Исследование кинетических закономерностей ингибирования PGH-синтетазы широким набором противовоспалительных и сходных с ними препаратов с целью классификации механизмов ингибирования и оценки сравнительной эффективности различных препаратов в качестве ингибиторов этого фермента.

2. Изучение структурных соотношений ингибитор—активный центр фермента. Использование ингибиторов различной структуры

5

и сравнительный анализ механизмов ингибирования и его эффективности способны, с одной стороны, дать информацию о наиболее необходимых элементах структуры лекарственных препаратов, обеспечивающих их физиологическое действие, с другой стороны, привести к экспериментально обоснованным гипотезам о структуре активного центра фермента.

3. Использование ингибиторов для целей дальнейшей детализации кинетического механизма действия PGH-синтетазы. В общем случае взаимодействие ингибитора с активным центром фермента может происходить на различных стадиях механизма трансформации субстрата в конечные продукты (взаимодействия со свободной формой фермента или с возможными интермедиатами в ходе катализа). Использование эффективных ингибиторов способно дать дополнительную информацию о кинетическом механизме действия фермента.

Были получены препараты PGH-синтетазы из двух иеточни-.ков •— из везикулярных желез барана и тромбоцитов человека — и проведено изучение ингибирования ферментов нестероидными противовоспалительными соединениями. Предварительное исследование показало, что наблюдаемые эффекты при воздействии нестероидных противовоспалительных соединений на активность PGH-синтетазы практически не зависят от чистоты используемого белкового препарата (гомогенный белок; фермент, включенный в •мембрану микросомной фракции; фермент, солюбилизированный в мицеллах детергента).

Аспирин — медленный необратимый ингибитор эндопероксидпро-стагландинсинтетазы

При добавлении к раствору PGH-синтетазы ацетилсалициловой кислоты наблюдается медленная потеря активности фермента в реакции окисления арахидоновой кислоты в PGH2. Скорость инактивации фермента увеличивается с ростом концентрации аспирина. Типичные наблюдаемые зависимости активности PGH-синтетазы от времени для фермента в микросомной фракции везикулярных желез барана представлены на рис. 2. Аналогичные зависимости наблюдаются для фермента из тромбоцитов человека.

Рис. 2. Кинетика изменения активности PGH-синтетазы при инкубации фермента (микросомы везикулярных желез барана) в растворах аспирина разной концентрации (мМ). / — 0,81; 2 — 2,35; 5 — 4,36. Условия: 32°С, рН 7,2, 20 мМ фосфата, 1,7% этанола, 0,1% твин-20. Ав — активность фермента в от- > сутствие ингибитора, А —активность'фермента в момент времени / при инкубации с ингибиторов

J_I_I_111,

20 W бОмин

б

I

Процесс инактивации фермента необратим. Существенное уменьшение концентрации ингибитора в среде путем разбавления раствора фермента с аспирином не приводит к появлению его активности. Инактивацию фермента нельзя объяснить его денатурацией, поскольку в контрольном опыте в отсутствие аспирина фермент практически полностью сохраняет свою активность.

Простейший кинетический механизм, описывающий наблюдаемые экспериментальные зависимости, имеет вид

Е + iXe/, (1)

где Е — свободная форма фермента; / — ингибитор; EI — соединение ингибитора с активным центром фермента.

В условиях избытка ингибитора по сравнению с концентрацией активных центров фермента (в случаях с нестероидными противовоспалительными соединениями это соотношение всегда имеет место) кинетику изменения концентрации активного фермента во времени будет описывать уравнение с

Е = ?0е-*Ч (2)

где Е0 — начальная концентрация активных центров;' 10 — начальная и постоянная концентрация ингибитора (10^>Е0). Поскольку измеряемая на опыте активность PGH-синтетазы линейно зависит от концентрации фермента, по тому же закону должна меняться и активность катализатора.

Зависимость (2) при ингибировании аспирином действительно имеет место, что иллюстрирует рис. 3. Кинетические кривые опи- * сываются уравнением первого порядка, при этом показатель экспоненты линейно зависит от концентрации ингибитора (рис. 36). Тангенс угла наклона этой зависимости позволяет определить константу скорости необратимого взаимодействия аспирина с активным центром фермента. Видно, что необратимая инактивация PGH-синтетазы аспирином сравнительно медленный процесс.

Соответствие кинетики инактивации фермента уравнению первого порядка в условиях избытка ингибитора указывает на то, что реакция между активным центром фермента и аспирином действительно протекает в стехиометрическом соотношении 1:1. Эти количественные результаты, полученные кинетическими методами, полностью согласуются с известными литературными данными . [14, 22, 23].

Индометацин и вольтарен — медленные, эффективные, обратимые ингибиторы * PGH-синтетазы

Инкубация PGH-синтетазы с индометацином так же, как и в случае с аспирином, приводит.к потере ферментом его активности, и этот процесс также развивается во времени (рис. 4). Принципиальное отличие в механизмах действия этих лекарственных пре-

7

паратов заключается в том, что индометацин представляет собой обратимый ингибитор PGH-синтетазы. '

Этот вывод основывается на двух сериях экспериментов.

1. Обратимость взаимодействия индометацина с PGH-синте-тазой следует из того факта, что после отделения ингибитора от фермента активность PGH-синтетазы восстанавливается. Так, PGH-синтетазу микросомной фракции тромбоцитов человека обрабатывали индометацином в концентрации 7,5-10—6 М в течение

60 мин

Рис. 3. Ингибирование PGH-сш-

тетазы аспирином. а — линеаризация данных рис. 2 в полулогарифмических координатах; концентрации аспирина (мМ): / — 0,81; 2 — 2,35; 3 — 4,36; б — зависимость наблюдаемой константы скорости инактивации первого порядка от концентрации аспирина

мин

Рис. 4. Ингибирование PGH-am-

тетазы индометацином. а — кинетические кривые изменения активности PG/V-синтетазы из везикулярных желез барана при инкубации фермента в растворах индометацина разной концентрации (мкМ); / — 1,4; 2 — 2,2; 3 — 3,8; 4 — 5,4. Условия: 32°С, рН 7,2, 20 мМ фосфата, 1,7% этанола, 0,1% твин-20; б — зависимость относительной предельной активности фермента от концентрации индометацина

40 мин. Остаточная активность в результате такой обработки составляла 28%- Однако после отделения микросом от раствора центрифугированием (105 000 g, 1,5 ч) и промывки их буферным раствором активность фермента восстанавливалась практически полностью (составляла 95% от исходной).

PGH-синтетазу из везикулярных желез иммобилизовали на DEAE-сефадексе. В результате обработки иммобилизованного фермента раствором 2,6-Ю-5 М индометацина в течение часа активность