Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

редположили, что фосфорилирование а-субъединицы связано с регуляцией процесса дефосфорилирования р-субъединицьи Однако работы последнего времени позволили пересмотреть эту точку зрения. Были подобраны условия, в которых а-субъединица не оказывала влияния на дефосфорилирование р-субъединицы [104—107]. Кроме того, с помощью различных протеинкиназ, фос-форилирующих КФ, показали, что на а- и р-субъединицах фосфо-рилируются одни и те же остатки серина, причем во всех случаях, р-субъединица фосфорилируется быстрее, чем а- или а'-субъеди-ница. Но более полная активация КФ зависит от фосфорилирования обеих субъединиц i[21, 96, 97, 106].

При высоких концентрациях Mg24" (ЮмМ) и АТФ (ЗмМ) КФ способна катализировать фосфорилирование своей собственной мо~

61

лекулы, сопровождающееся активацией фермента. Эта реакция полностью зависит от Са2+ и ингибируется ЭГТА [3, 33, 47, 108]. В условиях благоприятных для аутофосфорилирования (ЗмМ АТФ, 10—20 мМ Mg^), происходило включение фосфата в а- и .Р-субъединицы фермента. Характерной особенностью этого процесса является также зависимость его от рН [3, 109]. При рН 8,2 оно происходит быстрее, чем при рН 6,8, при этом в р-субъединицу фосфат внедряется с постоянной скоростью при любом рН, фосфорилирование а-субъединицы при рН 6,8 имеет лаг-стадию [3, 21, ПО]. Внедрение максимального количества фосфата, равного 7—9 молям на 1 моль аРуб, приводит к активации фермента, в 2—3 раза превышающей активацию при фосфорилировании цАМФ-зависимой протеинкиназой.

Хотя механизм аутофосфорилирования остается неясным, на основании имеющихся экспериментальных данных можно заключить, что КФ, активированная самофосфорилированием, характеризуется большим сродством к ионам Са2* и к субстрату (ФБ). Кроме того, установлено, что в молекуле фермента различаются' два типа остатков серина. Два.остатка 1-го типа модифицируются при низкой концентрации Mg2+ и АТФ, остальные 5—7 остатков 2-го типа фосфорилируются более медленно и только при высокой концентрации Mg-АТФ [3, 108, ПО].

Известен еще один способ активации КФ, связанный с действием протеолитических ферментов [23, 24, 48, 111—113]. В ранних работах в препаратах КФ из мышц был обнаружен белковый «ки-назо-активирующий» фактор (КАФ), повышающий активность фермента при рН6,8 [113—115]. Этим фактором оказалась Са2+-зависимая протеиназа [116]. Эффект активации фермента при ограниченном протеолизе трипсином и химотрипсином наблюдали также при изучении КФ из сердца и мозга [38, 115, 117]. Активирующее действие эндогенных протеиназ выявлялось при хранении очищенных препаратов КФ, которые за две недели при 4°С активировались в 12 раз [23]. Имеет ли физиологическое значение активация КФ протеолизом, пока остается неясным. Однако он широко использовался для изучения регуляторных свойств и функциональной роли субъединиц КФ [21, 23, 54, 112, 113, 118, 119]. В нашей работе с этой целью был применен субтилизин, действие которого вызывало 10-кратное увеличение активности КФ при рН 6,8. Одновременно с активацией фермента исчезала зависимость активности от Са2*. Такое же явление оказывало действие трипсина [14]. Протеолиз КФ субтилизином протекал более медленно, чем протеолиз трипсином, и это давало возможность детально анализировать изменение активности и структуры фермента во времени. Под действием протеиназ первой разрушалась •а-субъединица. Если сравнить активацию фермента цАМФ-зави-•симой протеинкиназой, которая главным образом зависела от фосфорилирования р-субъединицы, то активация протеолизом коррелировала с деградацией а-субъединицы. Следовательно, механизмы этих двух путей активации различны,, хотя в обоих случаях

62

повышалось сродство к белковому субстрату. Можно предположить, что в молекуле КФ, как и других регуляторных ферментов, каталитический компонент поддерживается в неактивном состоянии за счет взаимодействия с регуляторный, функцию которого выполняет, по-видимому, а-субъединица.

Фракционирование фермента, обработанного субтилизином, на колонке с фосфоцеллюлозой позволило разделить две фракции. Наиболее слабо связанная с ионообменником фракция, обладавшая активностью при рН 6,8, характеризовалась полным отсутствием зависимости фермента от ионов Са2* (рис. 2) [48, 112]. Анализ этой фракции методом гель-хроматографии и электрофореза в градиенте поли-акриламидного геля показал, что она представляет собой полипептид с м.в. 80 000—90000 [34, 113]. В процессе протео-лиза вслед за исчезновением а-субъединицы начиналась деградация р-субъединицы; у-субъединица оставалась без изменения [21—23, 34, 48]. Устойчивость у"сУбъеДиницы к протеолизу служила одним из аргументов, позволившим предположить ее ответственной за выполнение каталитической функции [3,21]. Однако, обработав КФ из мышц акулы и кролика химотрипсином, по отношению к которому оказалась устойчивой р-субъединица, Фишер и сотр. [54, 118,119] получили данные, указывающие на каталитическую роль р-субъединицы. Спустя несколько лет появилась работа Скастера и др. [58], в которой сообщалось, что 1,8 М LiBr в присутствии 100 мМ АТФ оказывает эффективное действие на диссоциацию КФ, в результате чего удалось отделить и очистить обладающую ферментативной активностью у-субъединицу. Полученная у-субъединица в виде димера у2 с м. в. 86 000 была активна при рН 6,8. В отличие от холофермента — у-субъединица. полностью теряла зависимость активности от ионов Са2*. В следующей серии работ эти же авторы также с помощью LiBr изолировали два комплекса — уб и ауб [59, 120, 121]. Комплексы характеризовались частичной потерей чувствительности к Са2_г, более высокой величиной константы Михаэлиса для АТФ, чем нативная неактивированная КФ. В то же время сродство комплексов: к ФБ практически не изменялось. Добавление гликогена не приводило к активации уб, характерной для холофермента, но актив-

ов

10 20

Рис. 2. Хроматографическое разделение-киназы фосфорилазы, обработанной субтилизином. На колонку с фосфоцеллюлозой наносили 5,4 мг КФ, обработанной субтилизином в течение 16 ч. Элюцию проводили' в линейном градиенте концентрации В-глицерофосфата (0,03—0,3 М); определение активности проводили прыг рН 6,8.

/ — выход белка, 2 — активность КФ в. присутствии Са2+, 3 — активность в отсутствие Са2+

¦¦ность ауб комплекса повышалась. Из результатов работы можно ¦было сделать заключение, что а-субъединица выполняет многие регуляторные функции, а каталитическими свойствами наделена у-субъединица. Следует также отметить, что сложно устроенная структура КФ и большой размер молекулы связаны с многообразными регуляторными свойствами фермента, в то время как катализировать ферментативную реакцию могли даже небольшие фрагменты, полученные после протеолиза КФ субтилизином [34, 48], химотрипсином [54, 118, 119], и выделенная из молекулы белка с помощью LiBr у-субъеднница [58, 120, 121].

Не вызывает сомнения, что регуляция активности фермента тесно связана с пространственной организацией молекулы белка. В связи с этим безусловный интерес представляют результаты, •

страница 19
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.11.2019)