али на сходство величин константы Михаэлиса Кт для ФБ и пептида и на различие величин Vm [70, 71]. Определив, что первые шесть аминокислот не имеют существенного значения для активности КФ, авторы использовали в дальнейшем октапептид, соответствующий центру фосфорилирования, и его аналоги [72]. Оказалось, что для узнавания центра фосфорилирования важными являются шесть аминокислот, среди которых особое значение имеют гидрофобные аминокислотные остатки — Вал-15 и Иле-13, а также Арг-16.

В последние годы выяснилось, что КФ может фосфорилировать ые только ФБ и собственную молекулу, но и ряд других белков, таких, как ГС [12, 13, 73] и компоненты тропонинового комплекса, тропонин Т и тропонин I [74, 75]. Фосфорилируемый участок в тропонине 1 очень сходен с центром фосфорилирования ФБ, за исключением того, что вместо серина он содержит треонин. Однако скорость фосфорилирования тропонина во много раз ниже, чем

58

ФБ [75]. В молекуле ГС киназа катализирует фосфорилирование • -одного остатка серина, находящегося на 7-м месте от N-конца \[12, 13, 76, 78]. В табл. 1 приведены фосфорилируемые киназой пептидные фрагменты, полученные из ФА, ГС и тропонина I. Участие КФ в фосфорилировании специфического центра ГС было показано как на очищенных препаратах, так и на ферменте, входя-

Таблица 1

Аминокислотная последовательность центров, фосфорилируемых КФ

Белок Последовательность аминокислот* Ссылка

10 14

Гликогенфосфо- Глу-Лиз-Арг-Лиз-Глн-Илс-Сер (р) - [65, 77]

рилаза -Вал-Лей-АлаТли-Вал-Глу 20

Гликогенсинтаза 1 5 7

Про-Лей-Сер-Арг-Тре-Лей-Сер(Р)- [12, 13 , 78 , 79]

-Вал-Сер-Сер-Лей-Про-Гли-Лей-Глу

10 15 11

Тропонии / Арг-Ала-Иле-Тре(Р)-Ала-Арг [75]

* Числа указывают положение аминокислот от N-конца каждого фер мента.

щем в состав гликоген-белкового комплекса [80]. Величины Кт для ФБ и ГС примерно одинаковы, в пределах 50—100 мкМ, а скорость реакции в случае ГС в 2—3 раза ниже. Этот факт свя-затл, возможно, с тем, что концентрация фосфорилазы в клетке выше по сравнению с ГС и соответственно равна 100 и 4 мкМ [80]. К характеристике субстратной специфичности относится также способность КФ фосфорилировать казеин [81]. В гетерогенной молекуле казеина специфичным для КФ оказался Л-казеин, в котором фосфорилировался остаток серина. Для полумаксимальной активности фермента требовалась концентрация казеина 80 мкМ, т. е. концентрация, близкая к величине Km для других субстратов, ФБ и ГС. Полученные результаты авторы использовали для обсуждения вопроса о количестве активных центров в молекуле КФ и склонны были считать, что каталитическую функцию выполняет одна субъединица. Однако в связи с широкой специфичностью КФ высказывалась и другая точка зрения — о возможном существовании двух активных центров в молекуле фермента ?82]. Следует отметить, что в литературе по этому вопросу нет единого мнения. В настоящее время проводятся интенсивные исследования по изучению роли субъединиц в регуляции активности КФ и участия их в каталитическом процессе.

59

Роль субъединиц в регуляции и каталитической активности КФ

Активация КФ под влиянием адреналина была замечена задолго до открытия цАМФ-зависимой протеинкиназы. В опытах in vivo и на очищенных препаратах КФ [6, 83, 84] это наблюдение привело к тому, что был открыт фермент, присутствующий в следовых количествах в препаратах КФ [7, 21, 23]. Фермент был выделен в гомогенном состоянии из ряда источников. Он состоит из двух типов субъединиц: регуляторной, связывающей цАМФ, и каталитической, на которой локализован активный центр. При образовании комплекса цАМФ с регуляторной субъединицей молекула фермента диссоциирует с выделением свободной каталитической субъединицы, способной фосфорилировать КФ [3,85]. Влияние адреналина на превращение ФБ в ФА в скелетной мышце связано с увеличением концентрации внутриклеточного цАМФ. Образовавшаяся при этом цАМФ-зависимая протеинкиназа, фосфорилируя КФ, пере-Еодйт ее в активированную форму, в свою очередь фосфорилирую-щую ФБ, вызывая тем самым активацию гликогенолиза. Таким образом, адреналин стимулирует деградацию гликогена посредством «каскадного» механизма, включающего активацию нескольких ферментных систем (рис. 1).

Справедливость приведенной схемы была доказана экспериментально не только для скелетной мускулатуры, но и для других тканей. Стимуляция гликолиза адреналином в сердечной мышце также связана с активацией КФ [37, 38]. Добавление адреналина

адреналин

аденилатциклаза (неактивная)

АТФ-

аденилатциклаза

цАМф

протеинкиназа (неактивная)

протеинкиназа 2+ /^_2+\

МЕ2+-АТф (CV+)

гликогенсинтаза гликогенсинтаза фосфорилаза Б фосфорилаза А (неактивная) (неактивная)

Рн

. гликоген (п)

гликоген (п-\)

Рис. 1. Каскад реакций, связанный с регуляцией распада и синтеза гликогена в

скелетной мускулатуре

60

'.в среду при перфузии изолированного сердца крысы приводило к 'быстрому увеличению активности ФА и увеличению уровня цАМФ [36, 86—90]. Наличие зависимого от цАМФ механизма активации КФ установлено также для гладкой мускулатуры [91, 92]. Адени-латциклазная система обеспечивает регуляцию активности КФ не. только адреналином, но и другими гормонами. Так, было показано, что глюкагон активировал фосфорилирование КФ путем увеличения уровня цАМФ в печени [40].

В настоящее время известно, что очищенные препараты КФ in vitro могут фосфорилироваться другими протеинкиназами: цГМФ-зависимой i[93], Са24"- и фосфолипид-зависимой [94, 95], цАМФ-не-зависимой [96], цАМФ- и Са^-независимой [97]. Однако наиболее-высокая степень активации КФ происходит под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы; именно этот процесс является ключевой ступенью в регуляции гликогенолиза. В последние годы большое, внимание было уделено изучению молекулярных механизмов активации КФ.

Считают, что полностью дефосфорилированная КФ характеризуется отношением активностей при рН 6,8 и 8,2, равным 0,01— 0,05. При инкубации такого фермента с цАМФ, АТФ, Mg24- и про-теинкиназой активность КФ возрастала при рН 6,8 в 25—50 раз, а при рН 8,2 —в 1,4 раза, т. е. отношение увеличивалось до 0,36. [3, 21, 23]. Активацию КФ цАМФ-зависимой протеинкиназой проводили при низкой концентрации АТФ (0,2 мМ) и Mg24- (2,0 мМ),. чтобы исключить аутофосфорилирование. Установлено что в этих условиях происходит включение 2 молей фосфата на моль сфуб. Активация КФ коррелирует с внедрением 1 моля фосфата в. Р-субъединицу; а-субъединица фосфорилируется более медленно, и ранее считали, что ее модификация не влияет на активность-фермента [23, 24, 98]; у-субъединица не подвергалась фосфорили-* рованию [21, 23]. Доказательством фосфорилирования а- и р-субъединиц служили опыты с использованием протеин-гликоге-новых частиц [99—102]. Кроме того, была показана идентичность-фосфопептидов, выделенных из а- и р-субъединиц после фосфорилирования КФ in vitro [98] и из КФ, активированной внутривенным введением кролику адреналина {101]. Коэн и Антонив [102, 103] п