Биологический каталог




Молекулярные основы действия ферментов

Автор С.Е.Северин, Г.А.Кочетов

конкурентном торможении второй фазы реакции гидролиза АТФ по сравнению с первой (см. выше).

Модель, приведенная на рис. 1, не только качественно, но и количественно хорошо описывает экспериментальные данные. Величина k3 легко измеряется как константа скорости торможения АТФазной реакции в присутствии избытка АТФ и азида (см. схему (17)). Она равна ~0,7 мин-1. Величина ks соответствует максимальной скорости активации АДФ-блокированного фермента в присутствии насыщающих концентраций АТФ; она равна ~2 мин-1. Отношение начальной скорости активированной АТФазы к установившейся после перехода во вторую фазу гидролиза АТФ определяется в соответствии с рассматриваемой моделью отношением выражений (19) и (22):

" -Звк.= fes + fea = 1,35. (23)

.иуст ^5

Полученная величина хорошо соответствует примерно 30%-ному торможению второй фазы реакции по сравнению с первой, особенно если принять во внимание, что величины k3 и k5 определены в независимых экспериментах. Модель предсказывает, что степень торможения во второй фазе реакции не зависит от концентрации АТФ, что при относительно больших концентрациях субстрата хорошо согласуется с экспериментальными данными; при концентрации АТФ<С/Ст двухфазности не наблюдается, по-

42

видимому, из-за очень длительного времени установления стационарного состояния.

Основная цель многочисленных (в том числе и наших) исследований, посвященных кинетике гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой, состоит в выяснении механизма «обратной» реакции — синтеза АТФ. В связи с этим возникает вопрос: какова роль кинетически значимых интермедиатов реакции гидролиза АТФ (см. рис. 1) в реакции фосфорилирования?

При обсуждении этой проблемы возможны два принципиально различающихся подхода.

Первый, пожалуй, наиболее популярный, основан на прямом приложении принципа микрообратимости к реакциям, катализируемым любым ферментом. При таком подходе фосфорилирование АДФ должно описываться обратной последовательностью реакций большого цикла схемы. Влияние электрохимического потенциала ионов водорода на АТФазную активность сводится при этом к обеспечению ее термодинамической обратимости. Последнее в соответствии с принципом Холдейна [83] неизбежно должно сказаться на кинетических параметрах фермента: Кт для субстратов и значении максимальных скоростей. В более конкретной, хотя и чисто гипотетической форме сказанное можно проиллюстрировать следующим образом. Допустим, что реакция (3) большого цикла схемы на рис. 1 непосредственно сопряжена с векторным переносом протона через Fo:

Это означает, что кажущаяся константа равновесия К для диссоциации комплекса Е-АДФ обратно пропорционально зависит от ДцН+.

Эта зависимость может выражаться в уменьшении константы скорости ki при увеличении Дц,Н+. В условиях необратимой утилизации АДФ пируваткиназной системой скорость гидролиза АТФ (v) будет определяться стационарной концентрацией Е-АДФ и константой скорости ki.

Уменьшение величины Др,Н+ добавлением разобщителей или возникновением неспецифических утечек протонов через сопрягающую мембрану либо невозможность векторного переноса протонов (растворимый Fi) приведет в этом случае к увеличению скорости АТФазной реакции вследствие увеличения k\. Так как в величину Km для АДФ в процессе окислительного фосфорилирования вхо« дит константа скорости распада комплекса Е-АДФ:

Е-АДФ^ Е + АДФ + Н+ и К = fc-i

(24)

v = h [Е-АДФ].

(25)

(26)

43

где А — комбинация кинетических констант стадий 2 и 1 большого цикла, снижение Д|д,Н+, приводящее к увеличению ki, должно привести к увеличению Кт Для АДФ. Сказанное является простой иллюстрацией соотношения Холдейна, согласно которому кинетические параметры прямой и обратной реакций, катализируемых единственным ферментом, не могут быть произвольными, а должны зависеть от константы равновесия реакции. Более детальное теоретическое рассмотрение принципа Холдейна можно найти в обзоре Клиланда [84], а его возможное приложение к функционированию митохондриальной АТФазы в обзоре Бойера [82]. Следует отметить, что недавно три независимые группы исследователей сообщили об экспериментально наблюдаемом увеличении констант Михаэлиса для АДФ и неорганического фосфата в процессе окислительного фосфорилирования [74, 85, 86]. Легко показать, что, если обратимая ферментативная реакция катализируется единственным ферментом, из принципа микрообратимости следует невозможность избирательного торможения любым ингибитором только одного направления реакции при условии, что ингибитор не влияет на положение равновесия (не реагирует с субстратами или продуктами реакции). Действительно, для реакции

Е

S <--»Р

соотношение Холдейна может быть записано так:

-Sg_ = K-= Г s ¦ (27)

l^PI vmax " Am

где Pp и Sp — концентрации субстрата и продукта в равновесии, определяемом константой КР; Vfmax и У?,ах — значения максимальных скоростей прямой и обратной реакции соответственно;

у К* —константы Михаэлиса для субстрата и продукта при протекании реакции в прямом и обратном направлениях. Если ингибитор (или активатор) изменяет VfmK!} то неизменность константы равновесия требует пропорционального изменения одного или одновременного изменения всех трех других параметров (Утах' /(Р). Сообщения об одностороннем торможении АТФазной реакции обычно касаются изменений скоростей, измеренных в оптимальных для данного направления условиях, т. е. величин, близких, но не идентичных Vmax. К сожалению, нам не известно ни одной работы, где влияние «одностороннего» ингибитора на «оптимальную» активность сопровождалось бы анализом его эффектов на три другие параметра, входящие в соотношение Холдейна [83].

Таким образом, существование «односторонних» ингибиторов в той мере, в какой изучена феноменология их действия, не противоречит представлению об АТФазной реакции как о реакции фосфорилирования, протекающей в обратном направлении (см.

44

краткое обсуждение проблемы односторонних ингибиторов в работе [87]).

Существует возможность принципиально иного подхода к проблеме обратимости окислительного фосфорилирования. Рассмотрим гипотетическую ферментативную реакцию гидролиза АТФ, сопряженную с векторным перемещением протона и происходящую по стадиям 1—4:

¦Е-АДФ

±АДФ

±АТФ ±Ф |

--- Е - АТФ «—!Е • АДФ * (28)

2 t

¦ 3 4

Ж-АДФ-^^-Е

±АДФ

Пусть, как и в предыдущем случае, стадия 4 сопряжена с переносом протона. Тогда все сказанное выше применительно к большому циклу схемы рис. 1 окажется справедливым для циклической реакции 1—4, и фосфорилирование АДФ представляет собой последовательность реакций 4—1. Уместно подчеркнуть, что сопрягающая функция фермента (гидролиз/перенос протона), по-видимому, должна состоять в строго детерминированной последовательности элементарных актов, следующих после активации кинетически инертной и термодинамически нестабильной молекулы АТФ при ее связывании в активном центре.

Допустим теперь, что при солюбилизацин Fi или при получении субмитохондриальных фрагментов происходит «незначительное» изменение структуры фермента, прив

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Скачать книгу "Молекулярные основы действия ферментов" (4.06Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.06.2019)