Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

объемах смеси хлороформ — метанол (1:2) и встряхивают смесь в течение 10 мин (160—170 встряхиваний в минуту). После этого добавляют еще 1 объем хлороформа и встряхивают еще 5 мин.

Гомогенат фильтруют через воронку с фильтром из пористого стекла и осадок реэкстрагируют 5 мл хлороформа. Фильтраты объединяют. В фильтрат прибавляют на 1 объем экстракта 0,2 объема 0,1 М КО и перемешивают (или центрифугируют), при этом образуется двухфазная система. Верхний слой с промежуточной фазой, если она образуется, отсасывается пипеткой. Экстракт упаривают на водяной бане при 40—50°С (под тягой). Для предохранения липидов от окисления и ускорения высушивания на образец рекомендуется подавать струю азота. Еще лучше полученный таким образом раствор липидов упаривать на роторном вакуумном испарителе. После этого определяют общее количество липидов.

Лабораторная работа № 30. Фракционирование липидов методом тонкослойной хроматографии

Ход работы. 1. Приготовление и хранение пластинок. На чистые и сухие стеклянные пластинки размером 200X200X3 мм наносят суспензию сорбента. Для получения сорбента тщательно перемешивают в ступке до однородной массы (или в смесителе) 25 мг силикагеля, 2 мг гипса и 0,06—0,08 мл воды из расчета на 2 см2 ловерхностй пластинки. Интенсивное и тщательное перемешивание суспензии улучшает качество слоя. Затем суспензию наносят ровным тонким слоем на пластинку и сушат в течение 0,5—1,5 ч на воздухе, а затем активируют в течение 30 мин при 120 °С и хранят в эксикаторе.

В настоящее время выпускаются готовые пластинки с различными сорбентами, однако для начинающих желательно пластинку готовить самостоятельно.

2. Нанесение пробы. На зону старта (1—1,5 см от края) наносят 0,01 мл экстракта (см. лабораторную работу № 29). Хроматограмму проявляют смесью гексана, диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты (73 : 25: : 2) в плотно закрытой камере, обложенной внутри фильтровальной бумагой. При восходящем движении проявителя в течение 1 ч он поднимается на 2/3 высоты закрепленного слоя силикагеля. Пластинку сушат под тягой 30 мин и опрыскивают 10 %-ным раствором фосфорно-молибде-новой кислоты, после чего нагревают в сушильном шкафу при 80—100 °С до появления синих пятен на желтом фоне.

Известно, что в первом пятне от линии старта сосредоточены фосфолипиды, во втором — неидентифицированные липиды, в третьем — холестерол, в четвертом — моногли-цериды, в пятом — диглицериды, в шестом — свободные высшие жирные кислоты, в седьмом — триглицериды и в восьмом — стериды. Непосредственно к линии фронта проявителя примыкают углеводы. Сравнивая полученную картину со стандартной, определяют состав липидов плазматических мембран клеток неисчерченных мышц.

Контрольные вопросы и задания

1. Расскажите об общей характеристике и функциях липидов мембран. 2. Каковы свойства фосфолипидов и их основные представители? -3. В чем заключается суть метода тонкослойной хроматографии?

3.14. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН

Наиболее важными составными компонентами мембран, участвующими в разнообразных процессах обмена веществ, являются молекулы белка и их надмолекулярные комплексы с другими веществами.

Мембранные белки, как правило, нерастворимы в воде и плохо растворяются в органических растворителях. Изучение химической природы белков осложнено тем, что в мембране они находятся в контакте с липидами и углеводами (липопротеины и гликопротеины), поэтому в последнее время для исследования белков мембран используют оптические и различные физические методы.

Однако методы прямого химического анализа мембранных белков не только не потеряли своего значения, но успешно разрабатываются. Одним из перспективных методов в настоящее время Является метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с использованием додецил-сульфата натрия (SDS) в качестве диссоциирующего агента. Этот детергент в высоких концентрациях (>0,1 %) соединяется с полипептидами и препятствует их агрегации.

Метод электрофореза в ПААГ обладает большей разрешающей способностью и высокой чувствительностью, хотя используются и другие гели. ПААГ — прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу и химически инертен. Он дает возможность исследовать растворы разной концентрации и в небольших объемах (до 0,001 мл), использовать охлаждение и быстро проводить разделение (в течение 60—70 мин).

Для препаративного фракционирования в ПААГ существует 2 типа оборудования: колонки, наполненные гелем, и большие пластины. Препаративное разделение белков в слое геля с использованием больших пластин является более удобным и более эффективным. Оно позволяет на одной пластине анализировать одновременно большое число образцов, а также пластины можно приспособить и для двухмерного разделения. Для этого пробу вначале фракционируют в гелевом столбике диаметром 4 мм, а затем этот гель вдавливают в верхнюю часть пластины со слоем геля и подвергают электрофорезу в перпендикулярном направлении.

Двухмерный электрофорез все чаще и чаще применяется для анализа белков мембран.

При использовании электрофореза в ПААГ для определения молекулярной массы белков очень важно соблюдать правильное соотношение между величиной пор геля и размером белковых частиц. Если диаметр частиц будет больше размера пор, то молекулы белка не смогут войти,в гель. Наоборот, если концентрация геля будет невелика и размер его пор будет значительно превышать диаметр белковых молекул, то последние практически не станут задерживаться гранулами ПААГ.

Кроме размера, некоторое значение при определении молекулярной массы белков имеет форма белковых молекул. Она должна быть сферической, при этом поведение белковых молекул во время электрофореза будет прямо зависеть от величины их молекулярной массы. Для достижения этой цели белки обрабатывают диссоциирующим раствором, содержащим SDS или мочевину и р-меркапто-этанол. При этом происходит разрушение четвертичной и видоизменение третичной структуры белковой молекулы; в рез

страница 89
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)