Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

нием во все пробирки 1 мл 1,5 %-й холодной ТХУ в той же последовательности, в которой добавляется белок.

Определяют неорганический фосфор, добавляя во все пробирки: 1 мл 2,5 %-го молибдата аммония на 5 н. H2SO4. 1 мл 2 %-й аскорбиновой кислоты, 1 мл НгО.

Пробирки центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин для осаждения белка, а затем колориметрируют против пробы, не содержащей белка, при X — 680 нм. Колориметрируют ие яозже 30 мин после добавления молибдата аммония.

Расчет активности фермента проводят по формуле (60).

Пример расчета. АЕ = 0,620; К = 0,040; t = 30 мин; i = 50 мкг.

0,620-1000-1000 имоль (Ра)

^ ^ 2 0,04-31-30-50 ~ ' мг(белка)-мин"-

Контрольиые вопросы

1. Какие трудности возникают при определении маркерных ферментов макросом? 2. Чем могут быть обусловлены артефакты при определении маркерных ферментов микросом? 3. Какие типы мембран присутствуют во фракции микросом? Как это установить? Чем обусловлено присутствие этих мембран? 4. На чем основано определение активности глюкозо-6-фосфатазы, НАД-Н-оксидазы, Саа+—АТФ-азы?

Лабораторная работа М 28.

Определение маркерных ферментов митохондрий

/.Определение активности цитохромоксидазы (К. Ф. 1.9.З.1.).

Определение загрязнения различных фракций мембран митохондриями возможно с достаточной степенью точности, так как митохондрии различных тканей имеют одни и те же маркерные ферменты (см. табл. 1). Цитохромоксида-за — фермент, расположенный во внутренней мембране митохондрий, участвует в переносе электронов в процессе окислительного фосфорилирования от цитохрома с на кислород

2 цит. Fe*+ -f- V2O2 —*¦ 2 цит. Fe5* -f- О2-. Рис. 90. Окисление а-нафтола и N, N-диметилпарафеиилдиа-мина

Для обнаружения цитохромоксидазы используется реакция окисления некоторых аминов и фенолов кислородом. Наиболее распространенный метод — окисление а-иафтола и N, N-диметилпарафенилдиамина (реактив Нади) с образованием иидофенолового голубого (рис. 90). Образовавшийся пигмент экстрагируют абсолютным спиртом.

Метод I. Ход работы. Готовят раствор субстрата, смешивая равные объемы растворов а-нафтола, парафенилди-амина и карбоната натрия в соотношении 1:1:1. В пробирки разливают по 1 мл субстрата реакции," а затем по 0,1 мл суспензии мембранной фракции (в контроль — 0,1 млН20). Инкубируют при 37 °С 30—60 мин и добавляют в каждую пробирку по 3 мл спирта. Пробы центрифугируют Ю мин при 6000 об/мин. Надосадочную.жидкость спектрофотомет-рируют при длине волиы 550 нм.

Активность фермента вычисляют исходя из того, что снижение оптической плотности иа единицу эквивалентно восстановлению 0,44 единицы кислорода.

Результаты выражают в единицах цитохромоксидазной активности: А = Af-0,44 = Е цитохромоксидазной активности (Е02). Сравнивают активность цитохромоксидазы во фракции ПМ с активностью ее в митохондриальной фракции.

Метод II. Ход работы. Второй метод является модификацией выше описанного способа определения цитохромоксидазной активности. Принцип метода заключается в окислении N, N-диметилпарафенилендиамина ферментом, в результате чего образуется пигмент с максимумом поглощения К = 510 нм, в количестве, пропорциональном цитохромоксидазной активности. Образовавшийся пигмент экстрагируют смесью абсолютного этилового спирта с тетрахлорэтилеиом. В ходе ферментативной реакции восстановленное состояние цитохрома с поддерживается диметилпарафенилендиами-ном.

Растворы цитохрома с и диметилпарафенилендиамина готовят'в день опыта и помещают на баню со льдом. Экстрагирующую смесь готовят, смешивая спирт и тетрахлор-этилен в соотношении 3:1.

В пробирки помещают по 0,2 мл 0,04 %-го водного раствора цитохрома с, по 0,2 мл суспензии мембран в фосфатном буфере, доводят водой до 1 мл и выдерживают при 3f °С 5 мин. Реакцию инициируют добавлением во все пробы, кроме контроля, 0,1 мл 0,4 %-го раствора ДФДА. Инкубируют пробы 1—5 мин до появления красной окраски. После окончания инкубации все пробы ломещают на лед и экстрагируют пигмент 4-кратным объемом смеси спирта и тет-рахлорэтилена. Этими растворителями пигмент извлекается полностью при слабокислой реакции среды (рН = 5,6— 6,0), которая создается в пробе после внесения в нее диметилпарафенилендиамина гидрохлорида. В случае необходимости можно довести рН в пробе до 5,6—6,0 разбавленной соляной кислотой. Пробирки центрифугируют при 6000 об/ мин. Надосадочную жидкость спектрофотометрируют при длине волны 510 нм против экстрагирующей смеси. Окраска устойчива в течение 10 мин.

Активность цитохромоксидазы выражают в наномолях окисленного ДФДА за 1 мин на 1 мг белка. Расчет активности осуществляют по калибровочному графику, который строится аналогично приведенным ранее (см. рис. 87).

Для построения калибровочного графика используют бихромат калия, в присутствии которого ДФДА иефермен-тативно окисляется с образованием красного пигмента. Устанавливают несколько рядов пробирок и разливают 0,02 %-й раствор бихромата калия от 0,1 до 0,9 мл, затем добавляют:

в I ряд — 0,15 мл 0,01 %-го раствора ДФДА

во II ряд — 0,20 мл —«—

в III ряд — 0,25 мл —«—

в IV ряд — 0,30 мл —«—

Добавляют фосфатный буфер таким образом, чтобы объем инкубационной смеси соответствовал 1,5 мл. Затем осуществляют экстракцию таким же образом, как и в опыте. Через 3—5 мин измеряют оптическую плотность при 510 нм.

2. Определение активности сукцинатдегидрогеназы (К. Ф.1.3.99.1.). Сукцинатдегидрогеназа прочно связана с внутренней митохондриальной мембраной и представляет собой флавопротеид, в молекуле которого в качестве кофермента

9 741 COONa С l

Сукцинат 2,6-Дихлорфенолиндофенол .

натрия

Фумарат 2,6-Дихлорфенолиндофенол натРия (лейкоформа)

Рнс. 91. Восстановление 2,6-дихлорфеиолиидофеиола

ковалентно связан флавинадениндинуклеотид (ФАД). Этот кофермент действует как акцептор водорода в следующей реакции: сукцинат + Е — ФАДч=ь фумарат + Е — ФАД-¦Н2.

Метод I. Ход работы. Один из методов определения сук-цинатдегидрогеназной активности основ

страница 86
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)