Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

ерментов микросом

/. Определение активности глюкозо-6-фосфатазы. Фракция микросом состоит в основном из фрагментов эндоплазматического ретикулума (ЭР), а также других типов внутриклеточных мембран. В результате того, что мембраны ЭР неоднородны по плотности, создаются препятствия полному разделению фракций. В связи с этим при выделении и очистке плазматических мембран наибольшие неприятности доставляют мембранные пузырьки, происходящие из ЭР. Они являются самой распространенной примесью, причем их маркерные ферменты не однозначны для разных тканей.

К маркерным ферментам эндоплазматического ретикулума клеток печени относят глюкозо-6-фосфатазу, многие ферменты системы переноса электронов. В других тканях обнаружены незначительные количества глюкозо-6-фосфа-тазы, в связи с чем используют другие ферменты-маркеры для определения чистоты фракции (см. табл. 1). Кроме того, при определении глюкозо-6-фосфатазы могут возникнуть артефакты из-за активности кислой и щелочной фосфатаз, для чего необходимо применять их ингибиторы (фтористые соединения, ЭДТА).

Микросомы мышечной ткани содержат свойственные им функционально-активные мембраны саркоплазматического ретикулума (CP). Наиболее приемлемый маркер для мембран, связанный с их функционированием,— Са2+—АТФ-аза. Однако Са2+-активируемые АТФ-азы присутствуют также в других мембранах, в связи с чем целесообразно количественно оценивать присутствие этих мембран по нескольким маркерам, для чего определяют также активность НАД-Н-дегидрогеназы.

Глюкозо-6-фосфатаза гидролизует глюкозо-6-фосфат с образованием глюкозы и неорганического фосфата (рис. 89). Поэтому метод определения активности глюкозо-6-фосфата-зы основан на регистрации количества освобождающегося в результате неорганического фосфата. о II

но-р-о-сн2 I

он

я юкозо-6-фосфатаза

;н2он н J—-о, Н

+ Н3Р04

Рис. 89. Гидролиз глюкозо-6-фосфата

Ход работы. Готовится инкубационная смесь (0,45 мл), концентрация реагентов в которой составляет: 17,5 мМ гистидина, 20 мМ глюкозо-6-фосфата, 1 мМ Na-ЭДТА.

Для каждого определения ставят 3 параллельные пробы. Объем инкубационной смеси каждой пробы — 0,45 мл.

Реакцию начинают добавлением во все пробы (кроме контроля) по 0,05 мл белка из раствора 500—1000 мкг/мл, чтобы его содержание в пробе составило 25—50 мкг. В контроль вместо белка наливают бидистиллированиую воду. Пробы и контроль инкубируют при 37 °С в течение 15 мии. Реакцию останавливают добавлением 2,5 мл 8 %-й ТХУ. После этого производят определение количества неорганического фосфата, для чего в пробирки разливают по 0,5 мл молибдата аммония на 5 н. H2S04 и 0,5 мл 2 %-го раствора аскорбиновой кислоты.

Пробы центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин для осаждения белка, а затем колориметрируют при i=680 нм против пробы, не содержащей белка. От момента добавления молибдата до момента колориметрирования должно пройти 30 мин.

Расчет активности фермента производят по формуле 2&.Е-1000-1000 имоль (Р„)

А~ КЩ "= мг(белка)-мии ^61'

где АЕ — значение экстинкции; j — концентрация белка в мкг (100); t — время инкубации (мин); k — калибровочный коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику (см. рис. 87); 2 — пересчет на 1 мл; 31 — молекулярная масса фосфора; 1000 — пересчет на 1 мг белка; 1000 — пересчет на 1 нмоль.

Пример пересчета: /С=0,04; г=15 мин; /= = 50 мкг; A?Cp=0,610.

2 0,610-1000-1000 имоль (Р„)

0,04-31 -50-15 ' мг(белка)-мии '

2. Определение активности НАД • Н-дегидрогеназы.

НАД-Н-дегидрогеназа относится к ферментам цепи переноса электронов и в небольших количествах содержится в мембранах ЭР, а также во внутренних мембранах митохондрий. Этот фермент переносит электроны от НАД-Н к акцептору (возможно, к одному из белков дыхательной цепи, содержащему негеминовое железо).

Метод основан на определении уменьшения концентрации НАД-Н (по изменению оптической плотности при Л=340 нм, характерной для восстановленного НАД-Н).

Ход работы. В пробирку для контроля, по которой устанавливают щели спектрофотометра, наливают следующие растворы: 0,1 мл трисгНС1 буфера; 0,2 мл K3Fe(CN)6; 0,2 мл НАД-Н; бидистиллированную воду др 3 мл.

В пробирку для определения активности фермента.добавляют белок (0,1 мл из раствора, содержащего 500—: 1000 мкг/мл) и регистрируют убыль (окисление) НАД-Н через 1, 6, 11 мин после добавления белка. Таким образом, объем инкубационной смеси составляет 2,9 мл. '

Расчет производится следующим образом. Известно, что значение экстинкции 0,207 соответствует 1-10-7 М окисленного НАД. Тогда активность НАД-Н-дегидрогеназы будет равна:

х-60-1000 моль(НАД-Н)

¦ А —--—-=------, (62)

jt мг(белка)-ч . . '

Ы0-7-Е84о

х= 0,207

где х — количество образовавшегося НАД; 60 — пересчет на Г ч; 1000 — пересчет на 1 мг; t — время измерения (мии); / — количество внесенного белка; дё340 — изменение оптической плотности.

Пример расчета: t—6 мин, / — 50 мкг A?340= 0,200.

1 • 10-7 • 0,200 • 60 • 1000 мкмоль (НАД • Н)

А -^ 90 —--

0,207-6-50 мг(белка)-ч

3. Определение активности Са2+—АТФ-азы. Саа+— АТФ-аза осуществляет гидролиз АТФ при активном транспорте ионов Са2+ в цистерны саркоплазматического ретикулума. В основе метода — определение неорганического фосфата, освобождающегося при гидролизе АТФ ферментом. •'

Ход определения. Готовят инкубационную смесь (1,9 мл) таким образом, чтобы концентрация реагентов соответствовала: имидазола 50 мМ; КС1 100 мМ; MgCb 3,5 мМ; азида Na 5 мМ; ЭДТА 3 мМ; оксалата натрия 2 мМ; АТФ 3 мМ; НгО. Для этого берут 0,1 мл 1 М имидазола, 0,2 мл 1 М КС1, 0,1 ,мл 30 мМ MgCl2, 0,1 мл 1000 мМ азида Na, 0,2 мл 30 мМ ЭДТА, 0,2 мл 20 мМ оксалата натрия, 0,2 мл 30 мМ АТФ и доводят водой до 1,9 мл (в опыте) и до 2 мл (в контроле) .

Пробирки помещают на баню и после достижения температуры 37 °С начинают реакцию добавлением во все пробирки 0,1 мл белка из раствора 1 000 мкг/мл. Инкубируют в течение 30 мин при 37 °С и останавливают реакцию добавле

страница 85
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)