кг); 1000 — пересчет на нмоль Рв; t — время инкубации (мин).

Пример расчета. A?i = 0,120; Д?2=0,085; Д?3= = 0,120; Д?ср=0,103; /(=0,03; /=50 мкг; г=15 мин.

0,103-1000-1000 нмоль(Рн)

А =-= 1 ^0 "v---

0,03-50-31-15 ' мг (белка)-мин'

2. Определение активности Na+, К+ — АТФ-азы. Другой маркер плазматических мембран — Na+, К+ — АТФ-аза (чувствительная к оуабаину), АТФ-фосфогидролаза, К. Ф.3.6.1.3. Однако в плазматических мембранах присутствуют АТФ-азы, нечувствительные к оуабаину, что может создавать артефакты при определении этого маркера.

Na+, К+-активируемая АТФ-аза — сложный мембранный комплекс, обеспечивающий гидролиз внутриклеточного АТФ в процессе активного переноса ионов калия в клетку, а ионов натрия из клетки. Работу этого комплекса можно разделить как минимум на две стадии:

а) в присутствии ионов натрия на внутренней стороне мембраны концевая фосфатная группа переносится от АТФ на фермент с образованием промежуточного комплекса — фосфорилированного фермента: Ыа+ВНутри+АТФ+?—*

* [NaE ~ Ф] + АДФ. Эта стадия подавляется ионами Са2+ но не оуабаином;

б) на следующей стадии реакции, в присутствии ионов К+, на наружной стороне мембраны происходит освобождение Na+ во внеклеточную среду с одновременным гидролизом на свободный фермент и неорганический фосфор. Ионы калия переносятся внутрь клетки: К+снаружи+ [Na+?~

~Ф] *Ма+Снаружи+К+внутри+Фн+?'. Эта СТЭДИЯ КЭЛИЙ-

зависимого гидролиза фосфорилированного фермента ингибируется оуабаином. Определение активности этого фермента основано на способности сердечного гликозида оуабаина ингибировать Na+, К+ — АТФ-азу. Определяют АТФ-азную активность мембранного препарата в определенной инкубационной среде и параллельно определяют АТФ-азную активность в присутствии гликозида. Na+, К+ — АТФ-азная активность определяется как разница величины активности в среде с оуабаином и без него.

Ход работы. В опытные пробы (3 пробирки) разливают по 0,9 мл инкубационной среды (а в контрольные — 1 мл), содержащей такие концентрации реагентов: 5,0 мМ АТФ; 5,0 мМ Mg С12; 100 мМ NaCl; 20 мМ КО; 0,25 мМ ЭГТА; 50 мМ трис-HCl при рН=7,0.

Параллельно разливают по 0,9 мл инкубационной среды, содержащей вышеперечисленные компоненты той же концентрации, а также оуабаин (или строфантин) в концентрации 0,1 мМ (или 1 мМ).

Все пробирки помещают на водяную баню и после создания в пробирках температуры 37 °С по секундомеру в строгой последовательности добавляют белок: 0,1 мл из раствора с исходной концентрацией 500—1000 мкг/мл. Инкубируют 10 мин при 37 °С, а затем останавливают реакцию добавлением во все пробирки по 1 мл холодной

Для выявления образовавшегося неорганического фосфора производят окрашивание по схеме, описанной выше.

Для развития окраски пробы должны постоять 30 мин. После этого их колориметрируют при А,=680 нм против пробы, не содержащей белка. Если осадок белка мешает определению, пробы центрифугируют 5—10 мин при 2000 об/мии.

Расчет активности фермента проводят по формуле (60).

Вычитая из общей АТФ-азной активности активность в среде, содержащей оуабаин, получим значение активности маркерного фермента — оуабаинзависимой Na+, К+ — АТФ-азы.

Пример расчета. AEi общей Mg2+, Na+, К+ — АТФ-азной активности — 0,840; Д?2 Mg2+ — АТФ-азы (в присутствии оуабаина)—0,750; /С=0,04; /=50 мкг; i= = 10 мин.

10%-й ТХУ.

А =

[Д?, — Д?2] 10е 0,04-31 -50-10

0,04-31-50-10

0,090- 10е

143,8

нмоль Р„

мг(белка) - мин Рис. 88. Калибровочный график для определения щелочной фосфатазы

1,2

OA

i05HH

О 200 400 600

Концентрация п -нитрофенола, нмоль

3. Определение активности щелочной фосфатазы (К. Ф. 3. 1.3.1.). К маркерным ферментам плазматических мембран от- доносится также щелочная фосфатаза (щелочная фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты, и-нитрофенилфосфатаза). Этот фермент в буферном растворе метилглюкамина расщепляет n-нитрофенилфосфат на п-нит-рофенол и ортофосфат. Активность фермента определяют по

количеству освобожденного л-нитрофенола, которое определяется фотометрически в щелочной среде. Степень интенсивности окраски раствора характеризует активность фермента.

Этот фермент характерен для везикул, получаемых из плазматических мембран. Наибольшая активность фермента обнаружена на щеточной каемке плазматических мембран эпителия кишок.

Ход работы. Во все пробирки разливают по 0,20 мл буфера. Добавляют по 0,2 мл суспензии мембран из раствора 1000 мкг/мл, а в контроль-—бидистиллированную воду. Преинкубируют 3 мин при 37 °С. Стартуют реакцию раствором субстрата по 0,05 мл. Таким образом инкубационная смесь будет содержать: 0,5 моль/л метилглюкаминового буфера (рИ=10,4±0,1); 10 мМ л-нитрофенилфосфата; 0,1 мМ Mg2+.

Инкубируют всю смесь 15 мин при 37 °С. В той же последовательности, в которой добавляли субстрат, добавляют раствор ингибитора по 2,0 мл. Через 30 мин измеряют оптическую плотность проб против пробы, не содержащей белка, при 405 нм (значение экстинции АЕ\). В обе кюветы добавляют по капле 20 %-й НС104, перемешивают и вновь измеряют оптическую плотность (АЕ2).

Расчет активности фермента выражают в наномолях и-нитрофенола, освобожденного за 1 мин 1 мг белка. Расчет активности фермента отсчитывают по калибровочному графику (рис. 88) по разности оптических плотностей (АЕ,— АЕ2). Контрольные вопросы и задания

1. Какова функция мембранно-связанных ферментов на примере Na+, К+ — АТФ-азы? 2. Назовите маркерные ферменты: а) длн плазматических мембран; б) для митохондрий; в) для ядер; г) для микросом. 3. Какие требования предъявляются к ферментам-маркерам? 4. Чем могут быть обусловлены артефакты при определении маркерных ферментов плазматических мембран? 5. Примеси каких органелл присутствуют во фракции плазматических мембран? 6. На чем основано определение активности Na+, К+ — АТФ-азы, 5'-нуклеотидазы, щелочной фосфатазы?

Лабораторная работа № 27.

Определение маркерных ф