Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

руживают противоположную картину.

2. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что внутренняя и наружная поверхности мембран различаются по своему белковому, липидному и углеводному составам, что также обусловливает биохимическую неоднородность мембран. Например, показано, что активность 5'-нуклео-тидазы и рецепторы инсулина обнаруживаются на наружной поверхности плазматической мембраны. В связи с этим активность фермента может не проявиться, если в процессе выделения ориентация мембраны изменится — наружная поверхность окажется внутри пузырька и активный центр будет недоступным для субстрата. Это же касается и аденилатциклазного комплекса, центр которого доступен для внутриклеточного субстрата; Na+, К+-зависимой АТФ-азы, активируемой ионами Na+ изнутри клетки, ионами К+ снаружи и расщепляющей внутриклеточный АТФ и т. д. Таким образом, маркерные ферменты клеточных мембран связаны с функционированием специализированного участка мембраны.

Фермент может служить маркером, если он: а) прочно связан с ее мембраной; б) при разделении фракций не подвергается активации или ингибированию; в) локализован исключительно в данном типе мембран. В табл. 1 перечислены наиболее часто определяемые и достоверно установленные биохимические маркеры для различных клеточных мембран.

На практике для более четкого контроля за чистотой полученных фракций определяют активность 2—3 мембранных маркеров для каждого типа мембран.

Следует указать, что количественная характеристика внутриклеточных органелл зачастую затруднена. Это обусловлено тем, что изопикнические точки различных органелл могут перекрываться, и фракционирование при одной и той же скорости седиментации приводит к оседанию фрагментов нескольких органелл. Трудности идентификации могут быть также связаны с тем, что различные ткани имеют разные маркеры для одних и тех же органелл. Например, маркерные ферменты одного типа мембран могут проявлять активность и в других типах мембран, например, 5'-нуклео-тидазой в основном обогащены плазматические мембраны, однако эта активность присутствует также в аппарате Гольджи и эндоплазматической сети.

Другой применяемый маркер плазматических мембран — Na+, К+— АТФ-аза, чувствительная к оуабаину, присутствует в плазматических мембранах различных животных клеток, хотя с определением этого фермента также возникают некоторые сложности. Зачастую этот фермент невозможно использовать в качестве маркера из-за высокой активности нечувствительной к оуабаину АТФ-азы — фермента, не являющегося специфичным маркером. Кроме того, из-за асимметричной локализации активного центра Na+, К+ — АТФ-азы могут возникать артефакты при определении активности этого фермента в случае, когда везикулярные структуры будут вывернуты наружу внутренней стороной.

Относительно определения маркера эндоплазматической сети также возникают определенные трудности. Четко установлено, что глюкозо-6-фосфатаза локализована в мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР) печени, тогда как в других тканях, за исключением почек, имеется небольшое количество этого фермента. В качестве маркеров ЭР используют также ферментные системы переноса электронов. Однако из-за биохимической гетерогенности ЭР в различных тканях может отсутствовать полный набор цепи системы переноса электронов.

Для микросом скелетных мышц, происходящих в основном из саркоплазматического ретикулума, наиболее удовлетворительным маркером является Са2+ — АТФ-аза. Для некоторых тканей вообще не найдено удовлетворительного, маркера микросом: для неисчерченных мышц, для культуры эмбриональных фибробластов крысы и др. Наиболее легко из внутриклеточных органелл идентифицируются митохондрии и ядра. Для этих органелл установлено, что их изопикнические точки относительно постоянны в различных тканях и выше, чем плазматических мембран. Кроме того, мембраны митохондрий различных тканей имеют одни и те же маркерные ферменты.

Относительно легко идентифицируются также лизосомы и пероксисомы.

Наибольшие трудности возникают при разделении и количественном определении плазматических мембран и эндоплазматического ретикулума. Разделение этих мембран затруднено вследствие того, что диапазон плотностей мембран ЭР перекрывает диапазон плотностей плазматических мембран (d= 1,095—1,115). Разделение по скорости седиментации можно осуществить лишь в том случае, если поверхностные мембраны представлены крупными фрагментами. Когда же размеры фрагментов плазматических мембран уменьшаются до размеров микросомальных пузырьков, полное разделение осуществлять невозможно.

Для количественной оценки поверхностных мембран используют также непроникающие метки — такие вещества, которые ковалентно связываются только с компонентами поверхностных мембран интактных клеток. В этом плане получил широкое распространение метод йодирования. Однако установлено, что радиоактивный йод (1251) связывается не только с компонентами мембран, но и цитоплазмы, а степень связывания зависит и от условий эксперимента, и от размера исследуемых структур. При этом важным условием эксперимента является уменьшение до минимума числа разрушенных клеток, для того чтобы получить достоверные количественные данные.

Оборудование: центрифуги типов ОПН-ЗУ42, УВР, ЦЛ-21; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность при Я=340—750 нм и снабженный кюветами емкостью 2 мл и толщиной 1 см; набор химической посуды оо штативом; термостат.

Материалы и реактивы: 1. Выделенные плазматические мембраны. .2. 0,1—0,5 М трис-HCl буфер (рН=7,0—7,4). 3. 35 мМ гистидин (рН = 6,5), 20 мМ раствор MgCl2. 4. 80 мМ раствор АМФ. 5. 10 %-й раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ). 6. 2,5 %-й молибдат аммония на 5н. H2S04. 7. 2 %-й раствор аскорбиновой кислоты (готовить перед опытом). 8. Аскорбиновая кислота. 9. 10 мМ раствор ЭДТА. 10. Би-дистиллированная вода. 11. 1 М раствор NaCl. 12. 200 мМ КО. 13. 50 мМ раствор MgCl2. J4. 5 мМ раствор АТФ. 15. 2,5 мМ раствор ЭГТА (используется для блокирования АТФ-аз, активируем

страница 82
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2019)