результатом работ 26.

27, 28. Лабораторная работа № 25.

Определение формы и размеров везикул фракции плазматических мембран методом негативного контрастирования

Ход работы. Принцип метода негативного контрастирования заключается в снижении везикулами ПМ эффективной толщины непрозрачного для электронов слоя красителя.

Выбор вещества для негативного контрастирования определяется целым комплексом требований. Это вещество должно иметь высокую плотность и быть устойчивым к воздействию электронного пучка, не изменять своей структуры при взаимодействии с исследуемым препаратом. После высыхания красителя на подложке должен создаваться аморфный слой. Наиболее часто для негативного контрастирования используются уранилацетат, фосфорно-вольфра-мовая кислота, молибдат аммония, уранилформиат, воль- -фрамат натрня.

Негативное контрастирование осуществляется различными приемами. Например, можно сначала смешать 1—2 %-й раствор красителя с исследуемым препаратом, а затем эту смесь нанести на пленку-подложку. (Пленка представляет собой слой толщиной до 20 нм, обладающий низкой и равномерной способностью рассеивать электроны и не обладающий собственной надмолекулярной структурой. Пленки получают из пластиков, углерода различными способами и наносят на сетки.) Можно нанести краситель на объект, который уже находится на пленке-подложке. Это особенно важно тогда, когда необходимо сократить время взаимодействия препарата с красителем. Если препарат находится в растворе какого-нибудь вещества (сахарозы), от которого необходимо избавиться, препарат наносят прямо на поверхность раствора красителя, сахароза растворяется, а исследуемые частицы остаются на поверхности.

При выборе красителя следует иметь в виду способность его проникать через плазматические мембраны. Это важно по следующим соображениям. Как видно из рис. 85, везикулы ПМ, суспендированные в растворе фосфорно-воль-фрамовой кислоты, наносят на подложку сетки. Фосфорно-вольфрамовая кислота в везикулы ПМ не проникает, а занимает пространство между ними. Получаемое в электронном микроскопе изображение соответствует плотности электронного луча в каждой точке, которая пропорциональна толщине слоя красителя. Частицы мембран вндны в виде их светлых очертаний на темном фоне. Рис. 85. Схема локализации везикул плазматических мембран в красителе:

/ — медная сетка; 2 — пленка-подложка (па-рлодиои, формовар); 3 — везикулы плазматических мембран; 4 — фосфорио-вольфрамо-вая кислота

Метод негативлого контрастирования сравнительно прост, тре-2 J 4 бует небольших затрат времени и

/ JL~> ¦¦¦•¦,<>¦•¦¦ особенно удобен для первого

\(ЦЪ Q. -go p-oo^S контроля чистоты мембранных и..«.....^..«.....м......г.г фрак11Ий Однако интерпретация

образцов иногда бывает затруднена и зависит от толщины слоя красителя, нахождения красителя над или под частицей, адсорбцией мембранными структурами молекул красителя, способностью красителя проникать внутрь везикулы.

На опорные сетки с нанесенной на них пленкой-подложкой помещают суспензию плазматических мембран. Через 1—2 мин фильтровальной бумагой снимают излишек препарата и наносят каплю 1 %-го раствора уранилацетата (или фосфорно-вольфрамовой кислоты), выдерживают на воздухе 10—12 мин и тщательно промывают дистиллированной водой.

Заключительный этап работы состоит в просмотре приготовленных образцов в электронном микроскопе и получении фотографий с целью решения вопроса о чистоте полученной фракции ПМ.

Контрольные вопросы и задания

1. Какие трудности существуют при электронно-микроскопическом исследовании биологических объектов и каковы пути их преодоления? 2. Назовите этапы метода ультратоиких срезов. 3. Назовите основные положении метода негативного контрастирования.

3.12. КОНТРОЛЬ ЧИСТОТЫ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАРКЕРНЫХ ФЕРМЕНТОВ

Чистоту выделенных мембранных фракций определяют по нескольким критериям. Часто применяется морфологическое определение с помощью электронной микроскопии (см. 3.11) в случае, если мембрана обнаруживает отчетливые морфологические признаки. Более конкретная оценка чистоты мембран осуществляется посредством определения удельной активности маркерных ферментов.

Маркерные ферменты специфичны для определенного типа мембран, локализованы в них и осуществляют биохимические процессы, соответствующие специфическим функциям данного типа мембран. Оценивают активность маркерных ферментов всех клеточных органелл как в исходном гомогенате, так и во всех фракциях, выделенных поэтапно в процессе получения конечной мембранной фракции. Это позволяет заключить, на каком этапе может происходить осаждение определенных мембран, оценить потери мембранных фракций и выход конечного мембранного материала, о чем судят по обогащению его маркерами (увеличению активности определенного мембранного маркера относительно исходного гомогената). Чем выше будет это обогащение, тем, следовательно, более гомогенен выделенный препарат.

Для различных объектов степень обогащения биохимическим маркером варьирует от 5 до 50. Зачастую необходимо оценить степень загрязнения конечной фракции (например, при выделении фрагментов эндоплазм этической сети либо плазматических мембран примесями мембран цитоплазматических органелл). Для таких расчетов необходимы все данные по фракционированию рассматриваемой ткани.

Сами по себе однотипные мембраны также проявляют гетерогенность, что обусловлено определенными причинами.

1. Мембрана может быть структурно неоднородна. Например, эпителий кишок и проксимальных извитых почечных канальцев существует в таких формах, как щеточная каемка и мембраны, не содержащие щеточной каемки и выделяющиеся в виде везикул. Такой структурной неоднородности соответствует биохимическая неоднородность: щеточная каемка мембран эпителия содержит значительные количества щелочной фосфатазы и мальтазы и меньшие количества других биохимических маркеров плазматических мембран — Na+, К+ — АТФ-азы и аденилатциклазы. Везикулярные препараты обна