Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

. Пропитка:

смола+ацетон (1:3) — 37 °С, 1 ч; —»— (1:1) —37°С, 1 ч; —»— (3:1) — 37 °С, 2 ч. Материал, помещенный в чистую смолу (запасной раствор), оставить на ночь в термостате при 37 °С. Затем пере-

Чг+8 741 Рис, 81. Получение стеклянных ножей. Пояснения в тексте

нести в заливочную смесь и оставить на сутки при комнатной температуре.

6. Заливка: материал пере-

нести в свежую заливочную смесь, разлитую в капсулы, и поместить на 36—72 ч в термостат при 60 °С для полимеризации.

Получение ультратонких срезов. При получении ультратонких срезов особое внимание следует обращать на качество ножа (алмазного или стеклянного).

Стеклянными ножами можно пользоваться короткое время, пока не разрушится режущий край. Желательно использовать их сразу после изготовления, поскольку стекло представляет собой переохлажденную жидкость, которая постепенно течет, в результате чего режущий край становится тупым. Приготовление ножей — процедура несложная. Стеклянные полоски тщательно моют детергентом и сушат на воздухе. Протирать их нельзя, так как в результате этого образуется электрический заряд и на стекле скапливается пыль. Стекло режут на квадраты со стороной 2,5 см. Квадраты затем ломают по диагонали (рис. 81). Край ножа необходимо проверить под стереомикроскопом. Когда свет отражается от края ножа, становятся отчетливо видны его дефекты. Край хорошего ножа должен быть очень тонким и прямым, без неровностей и зазубрин. От угла, через который проходит линия "напряжения, находится та часть ножа, которая позволяет получить наилучшие срезы (рис. 82). Противоположный угол с шипом непригоден для резки.

тонких срезов; б — нож для резки с небольшим шнпом; в — непригодный нож; 1 — участок, используемый для заточкн блока; 2 — участок, используемый для резки; 3 — зазубренный участок

Рис. 82. Оценка качества стеклянного ножа:

а — нож для получения ультра-

Рис. 83. Нож с прикрепленной к нему ванночкой Рис. 84. Блок, подготовленный для резки иа ультрамикротоме (вид сбоку (а) и сверху (б))

Готовые нсгжи следует ставить вертикально в специальные держатели. Перед установкой ножа на микротом к задней стороне его режущего края надо прикрепить ванночку для жидкости, в которой пла- 0 6 вают срезы. Ванночка изготовляется из виниловой изоляционной ленты или лейкопластыря и прикрепляется к ножу воском (рис. 83). При использовании металлической ванночки ее необходимо тщательно вымыть.

Из каждой капсулы после полимеризации получают блоки, которые затем разрезают с помощью ультрамикротома на слои толщиной 40—100 нм.

Перед резкой блок необходимо заточить, выделив необходимый для исследования участок. Поворачивая блок вокруг вертикальной оси, добиваются, чтобы свет отражался от поверхности под углом, позволяющим четко различать детали фиксированного материала. Лезвием безопасной бритвы блок обрезают так, чтобы его лицевая сторона содержала интересующий вас участок. Блок затачивают в виде 4-гранной пирамиды с плоской вершиной, которая и будет служить поверхностью для резки (рис. 84). Эта поверхность должна быть в форме трапеции — с меньшим верхним основанием (рис. 84, б), что снижает вибрацию, возникающую при прохождении режущего края ножа.

Перед резкой надо устранить все источники вибрации, убедиться, что заточенный блок надежно закреплен в держателе, а сам держатель прочно укреплен на микротоме. Нож необходимо установить под нужным углом и надежно закрепить на микротоме. Угол наклона ножа должен составлять 1—7°. Необходимо проверить параллельность края ножа и лицевой стороны блока. Большее основание трапеции должно быть обращено вниз.

В ванночку наливают 8—10 %-й раствор ацетона или спирта (для снижения поверхностного натяжения и лучшего расправления срезов). Мениск не должен быть слишком высоким или слишком низким. Начинать резать лучше всего средней третью ножа, а продолжать резку — самой лучшей его частью. Важно учитывать скорость резки. Для получения ультратонких срезов движение блока должно быть более быстрым.

V.+8* После того, как срезы расправятся, можно приблизительно определить их толщину по цвету в отраженном свете:

Окраска

Толщина, им

темно-серая серая

меньше 40

серебристая золотистая пурпурная

40—50 50—70 70-90

более 90

После того, как на поверхности мениска образуется лента срезов, их вылавливают на сетку (сетка представляет собой медный диск с отверстиями около 75 мкм). Для этого сетку захватывают тонким (глазным) пинцетом и опускают прямо на срезы. Сетку вынимают, нижнюю ее сторону промокают фильтровальной бумагой.

Для получения достаточно отчетливого изображения в качестве «электронных красителей» применяются соли тяжелых металлов (свинца, урана, висмута). Одним из наиболее эффективных является двойное контрастирование уранилацетатом и цитратом свинца. Для контрастирования .необходимы растворы:

1. 1 %-й водный раствор уранилацетата.

2. Свинцовый краситель по Рейнольдсу: смешать 1,33 г нитрата свинца, 1,76 г цитрата натрия и 30 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 50 мл. Тщательно взбалтывать 1 мин и периодически еще полчаса. Добавить 8 мл 1 н. NaOH и довести дистиллятом до 50 мл, взболтать; рН раствора должно быть равно 12,0.

Контрастирование срезов осуществляется следующим образом. На поверхность воска в чашке Петри наносят каплю 1 %-го уранилацетата и помещают сетку срезами вниз. Окрашивание продолжается 1 ч. Затем сетку промывают дистиллятом и переносят в каплю красителя по Рейнольдсу, где держат 20—30 мин. После этого сетки промывают 0,05 М щелочью и промокают фильтровальной бумагой. После этого срезы готовы для просмотра в микроскопе.

Заключительный этап лабораторной работы состоит в просмотре срезови получении фотографий фракции ПМ с целью установить форму и размеры везикул, присутствие других мембранных структур (митохондриальных, эндоплазматического ретикулума), актомиозиновых и колла-геновых нитей. При возможности установить процент загрязнения и сравнить эти данные с

страница 80
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(07.07.2020)