Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

реакционной смеси необходимо провести очистку используемых реактивов. Чаще всего неудовлетворительные результаты зависят от примесей катионов в соляной кислоте, которую рекомендуется предварительно очистить перегонкой и насытить далее хлороводородом до плотности 1,18.

Реактив Фолина титруют 1 н. раствором щелочи и на основании полученных данных рассчитывают его кислотность. Перед использованием реактив Фолина разбавляют водой до кислотности, соответствующей 1 н. раствору соляной кислоты.

В пробирки разливают по 0,1 мл суспензии мембран, затем по 0,1 мл 0,4 н. NaOH (пробирки с белком рекомендуется нагреть на лабораторной бане для лучшего растворения белка). Добавляют бидистиллированную воду до 1 мл. Готовят смесь: в цилиндр на 100 мл наливают 50 мл 2 %-го Na2C03, в отдельную пробирку наливают 0,5 мл 2 %-го тартрата натрия и 0,5 мл 1 %-го CuS04, содержимое из пробирки выливают в цилиндр и образовавшейся смесью ополаскивают пробирку и опять выливают в цилиндр. Смесь надо хорошо перемешать, дать постоять 10 мин.

Затем во все пробирки добавляют по 10 мл смеси и хорошо перемешивают, после чего добавляют реактив Фолина. Надо учитывать, что реактив тяжелее полученной смеси и поэтому опустится на дно. Перед добавлением реактива Фолина во все пробирки вставляют Содержание бета в пробе, мкг стеклянные палочки и одновременно с добавлением реактива помешивают содержимое пробирки. Для развития окраски пробы должны постоять 30 мин. Затем измеряют оптическую плотность при Х=750 нм.

Содержимое белка в испытуемых пробах устанавливают по калибровочному графику, который строят на основе чистого белка точно известной концентрации. Метод дает абсолютные данные только в том случае, если калибровочный график построен по тому же самому белку, определение которого ведут посредством этой цветной реакции. В случае определения концентрации мембранных белков калибровочный график строят по бычьему сывороточному альбумину: готовят серию растворов белка с содержанием от 20 до 400 мкг в 1 мл. С каждым из указанных растворов производят не менее пяти раз реакцию Лоури, применяя весь ход определения, описанный выше. Строят калибровочную кривую (рис. 80).

II Количественное определение белка по биуретовой реакции.

Определение концентрации белка можно осуществить, используя только одну из вышеописанных реакций на белок — биуретовую. Эта реакция не отличается высокой чувствительностью, но сам метод может быть доступен для любой лаборатории. Возникающая окраска сине-фиолетового цвета осуществляется за счет пептидных связей и пропорциональна их количеству.

Ход работы. Готовится биуретовый реактив: в мерную посуду на 250 мл вносят 0,375 г сульфата меди, 1,5 г тарт-рата натрия-калия растворяют в 150 мл воды. Затем при энергичном помешивании добавляют 75 мл 10 %-го раствора NaOH и 1 г йодида калия и доводят содержимое до 250 мл водой. Реактив не подлежит длительному хранению в стеклянной посуде, поэтому его рекомендуется хранить в полиэтиленовом сосуде или в стакане, покрытом изнутри парафином.

Для определения берут в три пробирки по 0,2 мл исследуемого раствора белка, доводят бидистиллированной водой до 1 мл, добавляют 4 мл биуретового реактива и перемешивают. В контроль вместо белка добавляют воду. Через 30 мин измеряют оптическую плотность исследуемых проб при длине волны 540—650 нм против контроля.

Содержимое белка в исследуемых пробах устанавливают по калибровочному графику, который строят на основе чистого белка. Готовят три серии стандартных растворов, содержащих от 1 до 10 мг белка в 1 мл раствора. Разведение до необходимых концентраций белка при приготовлении серии раствора осуществляют 1 %-м раствором хлорида натрия. Описанным выше способом проводят подготовку проб для измерения оптической плотности: берут по 0,2 мл исходного раствора с известной концентрацией, доводят до 1 мл бидистиллированной водой и добавляют 4 мл буферного реактива. Колориметрируют через 30 мин в кюветах толщиной 1 см при 540 нм против контроля (вместо раствора белка берут 1 мл бидистиллированной воды). Определение повторяют трижды, беря каждыый раз новую серию стандартных растворов белка, о полученным значет ниям экстинции строят калибровочную кривую.

Для определения по построенным графикам (пункты I и II) концентрации белка необходимо соединить горизонтальной линией полученное для данного белка значение оптической плотности на шкале ординат о калибровочной кривой и из точки пересечения последнего на ось абсцисс опустить перпендикуляр. Точка пересечения последнего с осью абсцисс укажет содержание белка в микрограммах ft пробе.

Контрольные вопросы и задания

1. Назовите основные условия и этапы выделения ПМ клеток. 2. Как осуществляется центрифугирование в градиенте плотности сахарозы? 3. Какие реакции осуществляются при определении концентрации белка методом Лоури? 4. Что такое калибровочная кривая? 5. В чем сущность биуретовой реакция? 6. Как определить концентрацию белка, используя калибровочный график?

ЗЛ1. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЧИСТОТЫ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ

Электронная микроскопия больше других методов способствовала изучению морфологии клетки и организации внутриклеточных органелл. Возможность получения непосредственного изображения с высоким увеличением используется почти во всех областях биологии.

Появление электронного микроскопа привело к радикальным переменам в изучении биологической ультраструк-

V28 741 туры. Микроскопия совершила скачок, предопределивший возможность прямого наблюдения структур на молекулярном уровне. Однако и электронная микроскопия имеет некоторые ограничения: а) хотя разрешающая способность электронных микроскопов около 0,3 нм и ниже, достижимое для биологических образцов разрешение обычно не превышает 1—0,5 нм; б) хотя биологические структуры — трехмерные объекты, изображение, формируемое в электронном микроскопе, представляет собой двухмерную проекцию структуры (последние сверхвысоковольтные микроскопы дают возможность получить информацию

страница 78
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)