5 — блок компенсации

На рис. 62 приведена конструкция тонкослойной ячейки с прозрачным дном и вмонтированным над ним дисковым золотым электродом, к тыльной стороне которого подводится прижимной токопровод. В ячейке фиксируется также хлорсеребряный электрод сравнения, который контактирует с суспензией хлоропластов, помещенной в зазор между прозрачным дном ячейки и плоской поверхностью золотого электрода. Вызываемое одиночным световым импульсом или серией вспышек, наносимых с интервалом в 5 с, изменение тока в системе в результате восстановления выделяющегося кислорода на поверхности электрода, как правило, невелико. Поэтому для усиления сигнала следует использовать быстродействующий усилитель тока с высоким входным сопротивлением. Можно также использовать самодельный прибор — инвертирующий усилитель с масштабным коэффициентом передачи, собранный на базе интегральной микросхемы К284УД1А и описанный В. М. Головиновым и В. С. Даниловым (1974). Блок-схема усилителя, рекомендуемого для использования в данной работе, приведена на рис. 63. В усилителе предусмотрена Рис. 62. Конструкция тонкослойной ячейки для потеициостатнче-ского определения кислорода в суспензии хлоропластов:

1 — хлорсеребряный электрод; 2 — корпус ячейки, изготовленной из плексигласа; 3 — прозрачное дно из оптического стекла; 4 — тонкий слой суспензии хлоропластов; 5 — дисковый золотой электрод; 6 — прижимной токопровод

±4 3±

Рис. 63. Блок-схема усилителя для измерения динамики выделения кислорода в суспензии хлоропластов:

1 — блок компенсации; 2 — инвертирующий усилитель с масштабным коэффициентом передачи; 3 — измерительный (рабочий) электрод; 4 — иеполяризующийся электрод сравнения; 5 — блок поляризации

частичная компенсация сигнала и система поляризации хлорсеребряного электрода.

Вспомогательная цепь развертки должна быть синхронизирована со вспышкой. В этом случае на экране осциллографа регистрируется полная кривая выделения кислорода хлоропластами на конечном отрезке абсциссы от t—О до t-*-oo.

Помимо установки для выполнения работы необходимо то же оборудование, что и в предыдущей лабораторной работе. N

Материалы и химреактивы: перед началом работы проводят выделение препаратов хлоропластов методом дифференциального центрифугирования. Полученную фракцию хлоропластов суспендируют в среде выделения и после гомогенезации разводят в 3—4 мл среды. В полученной суспензии определяют концентрацию хлорофилла.

Для выполнения работы на основе среды выделения, содержащей 0,4 М сахарозы, 50 мМ трис-HCl буфера при рН—7,8, 50 мМ хлорида натрия и 2 мМ хлорида магния, готовят исходные растворы ряда соединений. Определенный объем этих соединений должен перед опытами вводиться в суспензию хлоропластов. Концентрации соединений в ячейке должны быть следующими: а) никотинамид-динуклеотидфосфат (НАДФ+) — 0,5 мМ/л; диурон — 5 мкМ/л'; в) и-трифторметоксикарбонилцианидфенилгид-разон (ФКФ) — 2 мкМ/л; г) салицилальдоксим (САК) — 0,8 мМ/л. Лабораторная работа № 15. Обработка экспериментальных данных, получаемых при потенциоетатическом определении кислорода в суспензии хлоропластов

Как видно из типичной кривой индуцированного вспышкой света кислородного обмена, приведенной на рис. 64 (кривая а), выделение кислорода в суспензии хлоропластов происходит )с временной задержкой порядка ,150— 200 мс. Эта задержка связана с диффузией кислорода, выделяющегося на внутренней поверхности тилакоидных мембран, к поверхности золотого электрода. Поэтому для определения истинной скорости процессов выделения кислорода полученные в опытах кривые ток — время необходимо обработать, внося поправку на диффузию кислорода. С этой целью определяют время задержки (t3) и кривые ток — время перестраивают в тех же координатах, смещая каждую точку экспериментальной кривой по оси X к началу координат на величину, равную t3. Перестроенная кривая приведена на рис. 64 (кривая б).

Затем перестроенную кривую анализируют так же, как и экспериментальные зависимости, описывающие сдвиг рН в суспензии хлоропластов (см. работу № 14). Полученные результаты следует представить в виде амплитудно-частотных спектров.

Лабораторная работа № 16. Определение динамических параметров выделения кислорода

в суспензии хлоропластов быстродействующим потенциостатическим методом

Ход работы. Суспензию хлоропластов с эквивалентным содержанием хлорофилла 250—300 мкг/мл вносят в зазор тонкослойной ячейки между ее прозрачным дном и поверхностью золотого электрода. Рабочий объем ячейки ограничен площадью золотого электрода (S=0,65 см2) и толщи-

а — экспериментальная кривая (t3 — задержка выделения кислорода); б — перестроенная кривая, приведенная за вычетом временной задержки

Рис. 64. Типичная кривая индуцированного вспышкой выделения кислорода в суспензии хлоропластов:

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 X=1-exp(~pt) р=0,23С' ной зазора (50 мкм). В ходе опыта потенциал рабочего электрода необходимо поддерживать равным —0,4 В. Равновесный потенциал восстановления кислорода при рН среды=7,8 равен примерно +0,75 В; потенциал, при котором фактически наблюдается быстрое восстановление кислорода на золотом электроде, составляет около +0,1 В. Таким образом, при <р = — 0,4 В весь кислород, который может поступать в тонкий слой, быстро восстанавливается и в стационарных условиях его концентрация в ячейке практически равна нулю — в основной части рабочего объема ячейки поддерживаются анаэробные условия.

В процессе эксперимента некоторое количество кислорода может поступать за счет диффузии из внешнего объема в тонкий слой. По периметру электрода происходит восстановление кислорода, проникающего извне. За счет этого процесса на электроде все время протекает некоторый остаточный фоновый ток восстановления (~5-10~7А), который компенсируется при помощи блока компенсации (см. рис. 55). Благодаря этому в ходе экспериментов можно регистрировать только изменения общего тока при воздействии световых импульсов на суспензию хлоропластов.

Перед действием вспышки хлоропла