5 дней.

Лабораторная работа М 7.

Выделение хлоропластов методом дифференциального центрифугирования

Ход работы. Все процедуры выделения хлоропластов ведут при 0—4 °С, не допуская прямого попадания света на растворы, содержащие хлоропласты. Эти меры необходимы для сохранения функциональной активности хлоропластов.

Навеска листьев в 2 г, предварительно охлажденная в течение 20 мин в полиэтиленовом пакете в холодильнике, размельчается в фарфоровой ступке на холоде в течение 1—2 мин с 5-кратным количеством (от массы) среды выделения.

Гомогенат пропускают через двойной слой полотна и центрифугируют 5 мин при 800 об/мин. Осадок, содержащий обрывки тканей, ядра, разрушенные клеточные оболочки и другие фрагменты, отбрасывают. Супернатант для осаждения хлоропластов центрифугируют 15 мин при 2500 об/мин. Осадок, содержащий хлоропласты, промывают средой выделения и центрифугируют 15 мин при 2500 об/мин. Хлоропласты гомогенизируют, и объем гомо-гената доводят средой выделения до 30—40 мл (при определении фотофосфорилирования — до 10 мл).

Полученный препарат хлоропластов следует держать при температуре 0—4 °С. В этих условиях активность хлоропластов сохраняется несколько часов.

Дальнейшая очистка препаратов хлоропластов от компонентов клетки осуществляется путем центрифугирования их в ступенчатом градиенте плотности сахарозы.

Для получения градиента плотности сахарозы в центрифужные пробирки (с прозрачными стенками) объемом около 40 мл с помощью пипетки осторожно по стенке наслаивают столбик ступенчатого градиента сахарозы, приготовленной на основе среды выделения. Структура градиента следующая:

нижний слой — 1,5 М сахароза, объем 5 мл,

средний слой — 1,0 М сахароза, объем 10 мл,

верхний слой — 0,8 М сахароза, объем 7 мл.

Сверху наслаивают около б мл суспензии хлоропластов. Пробирки уравновешивают и центрифугируют 20 мин при 2500 об/мин. Полученные при фракционировании отдельные зоны хлоропластов отсасывают с помощью шприца, собирают в отдельные пробирки, разбавляют до конечной концентрации сахарозы 0,4 М и просматривают под микроскопом.

Различные по величине фрагменты хлоропластов и целые хлоропласты обычно распределяются по фракциям следующим образом (рис. 47):

фракция 1 — содержит в основном фрагменты хлоропластов;

фракция 2 — наиболее густая суспензия хлоропластов с большим числом средних и примесью крупных хлоропластов и фрагментов;

фракция 3 — крупные целые хлоропласты с небольшой примесью средних. Фрагменты отсутствуют.

Для определения содержания хлорофилла в гомогенате и различных фракциях хлоропластов используется метод, предложенный Д. И. Арноном (1949).

К 2 мл соответствующей суспензии хлоропластов добавляют 8 мл 100 %-го ацетона. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр № 2—3, доводят 80 %-м ацетоном до о,ш-

0,8М~

Рис. 47. Разделение суспензии хлоропластов в WM—-__ градиенте плотности сахарозы иа отдельные ,г„ s

фракции (/, 2, 3) ь5"—\^ 10 мл и оптическую плотность раствора промеряют на спектрофотометре при 652 нм против 80 %-го ацетона. Концентрация хлорофилла рассчитывается по формуле

ZW1000

Содержание хлорофилла в 1 мл суспензии:

Ю

С= 1000-2,0 " <45>

В серийных .опытах содержание хлорофилла (в миллиграммах) в 1 мл исходной суспензии можно рассчитать, умножая оптическую плотность (D652) на постоянный коэффициент Контрольные вопросы

1. В чем заключаются сходство и отличия в структуре и функции мембран хлоропластов и митохондрий? 2. Как протекают углеводные циклы в хлоропластах, обеспечивающие образование гексоз? 3. Каково влияние неводных факторов на реакции синтеза и гидролиза АТФ в хлоропластах?

3.6. ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВЕТОИНДУЦИРОВАННЫХ СДВИГОВ рН В СУСПЕНЗИИ ХЛОРОПЛАСТОВ

Изолированные хлоропласты при освещении способны осуществлять процессы Н+-транспорта, сопряженные со светоиндуцированным переносом электронов по редокс-це-пям, встроенным в фотосинтетические мембраны. Так, освещение суспензий хлоропластов вызывает выделение Н+ при окислении воды внутри тилакоида, транспорт Н+ из наружного раствора во внутритилакоидное пространство и поглощение Н+ при восстановлении НАДФ+, которое происходит на наружной поверхности мембраны. Эти процессы светоиндуцированного Н+-транспорта вызывают образование трансмембранного градиента рН в хлоропластах.

Согласно теории П. Митчела (1966, 1968), этот градиент выравнивается в результате транспорта Н+ из внутритила-коидного пространства в наружный раствор. Транспорт происходит через АТФ-синтезный участок мембраны, что приводит к синтезу АТФ. Таким образом, процессы Н+-транспорта являются важнейшим звеном в цепи реакций превращения энергии света в фотосинтетических мембранах. Хотя молекулярные механизмы Н+-транспорта изучены недостаточно, показана зависимость величины градиента рН от интенсивности и спектрального состава света, скорости и путей переноса электронов по редокс-цепям хлоропластов, наличия ряда кофакторов, проницаемости фотосинтетических мембран.

Изучение процессов светоиндуцированного Н+-транспор-та представляет большой интерес не только в теоретическом, но и практическом отношении, в частности, для разработки методов анализа функционального состояния хлоропластов и поиска путей регуляции фотосинтетических процессов.

Светоиндуцированные процессы Н+-транспорта можно изучать различными методами. Один из них, предложенный У. Пиком и М. Авроном (1976), основан на измерении трансмембранного градиента рН по распределению слабых кислот (диметилаксазолидиона) или слабых оснований (метиламина, хлорида аммония) между тилакоидамй и наружной средой. О распределении аминов можно судить посредством косвенных приемов — по стимуляции светоиндуцированного. поглощения Н+ в суспензии хлоропластов.

Широкое распространение получил способ оценки трансмембранного градиента рН (его величины и динамики) по> изменениям флуоресценции аминоакридинов (Шульдинер, Ротенберг, Аврон, 1972). Метод основан на том, чт