Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

в клетках печени (только положительно заряженных липосом). В зависимости от состава липосомы могут проявлять токсическое действие в отношении HeLa клеток, останавливать пролиферацию опухолевых клеток. Помимо токсических свойств чужеродных липидов существуют еще и трудности иммунологического характера, так как часть молекулы фермента, включенного в липосому, может локализоваться на внешнем ее монослое. Эти и другие потенциальные препятствия на пути применения липосом усложняют поиск подходов и методов процессов слияния липосом с ПЛМ и клеточными мембранами.

Однако эти трудности не являются камнем преткновения. Наоборот, они направляют исследования на выяснение интимных механизмов взаимодействия искусственных и клеточных мембран, на выяснение механизмов изменения активности биологически важных мембранных комплексов под влиянием экзогенных липидов, механизмов изменения поведения и функций клеточной поверхности и поверхности мембранных ультраструктур клеток. Особое значение имеют исследования возможности липосом пересекать барьеры во внесосудистое пространство, что опять-таки может быть решено через изучение механизмов взаимодействия, контактов, слияния и реконструкции мембранных систем.

Глава III. ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

3.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ НЕИСЧЕРЧЕННЫХ МЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ

Многие аспекты функционирования мышечных клеток позвоночных невозможно изучить in vivo на ткани из-за окружающей их плотной коллагеновой сети. Электронная микроскопия дала некоторые сведения о структурных изменениях при выполнении основной функции мышечных клеток — сокращении, однако трудности получения срезов определенной ориентации и отсутствие возможностей для трехмерных исследований являются существенными ограничениями.

Метод исследования изолированных клеток позволяет избежать многих трудностей в работе с мышечной тканью. Кроме того, он позволяет ответить на вопросы о том, какова функциональная природа организации мышцы, возможно ли нормальное функционирование отдельных неис-черченных мышечных клеток и чем оно отличается от функционирования клеток, объединенных в ткань. Ведь результаты, полученные при изучении интактной ткани, отображают следствия сложной организации мышечных клеток в многоклеточный комплекс.

Важное преимущество метода заключается в том, что на изолированных клетках можно наблюдать не только моменты до и после сокращения, как на фиксированных препаратах, но и саму динамику сокращения. Кроме того, исследование всей клетки, а не среза позволяет наблюдать в какой-то мере трехмерность процессов.

Оборудование: химическая посуда, магнитная мешалка, оптический микроскоп с фазовоконтрастным устройством, ультразвуковой дезинтегратор, спектрофотометр.

Материалы и реактивы: трипсин, коллагеназа, трипано-вый синий, АТФ. Раствор I. Модифицированный раствор Хэнкса: 137 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 1,1 мМ Na2HP04, 0,4 мМ КН2Р04, 0,4 мМ NaHCOs, 5,5 мМ глюкозы, ионы Са2+ и Mg2+ отсутствуют. Раствор II. 137 мМ NaCl, 5 мМ КО, 4,0 мМ NaHC03, 5,5 мМ глюкозы, 5,0 мМ СаС12. Растворы приготавливаются на Трис-HCl буфере (рН = 7,3 при 37 °С). Лабораторная работа М 1.

Методика выделения изолированных клеток

Ход работы. Взятую у животного ткань (taenia coli морской свинки) тщательно промывают раствором I (4°С), разрезают на кусочки размером 0,5—1 мм и в течение 1 — 1,5 ч выдерживают при комнатной температуре в растворе I, в который добавлен ЭГТА (0,3—0,5 мг/мл). ЭТТА действует как релаксант и эффективно «подготавливает» ткань к последующему воздействию коллагеназы. Затем кусочки ткани переносят в бюкс с находящимся в нем остекленным магнитом и заливают 5—10 мл свежеприготовленного раствора трипсина (на растворе I, концентрация 1 мг/мл). Бюкс помещают в термостат (36 °С) на магнитную мешалку при вращении магнита со скоростью 50—60 об/мин. Через 1 ч переваривание ингибируют соевым ингибитором трипсина (3 мг/мл). Затем раствор трипсина заменяют раствором коллагеназы (0,4—0,5 мг/мл, приготовленным на растворе II, в котором содержатся ионы Са2+, активирующие коллагеназу). Через 30—40 мин клеточную суспензию осаждают центрифугированием (1000 об/мин) и осадок, состоящий из изолированных клеток, ресуспендируют в растворе I (рис. 35).

Прежде чем использовать изолированные клетки в исследованиях, необходимо убедиться, что процедура изолирования не повлияла на их структуру и свойства. При этом руководствуются следующими критериями: а) целостность плазматической мембраны; б) спонтанная и вызванная физиологически активными веществами сократительная активность; в) сохранение клетками ультраструктурных особенностей интактной неисчер-ченной мышечной ткани; г) спонтанная сократительная активность изолированных клеток исследуется в поле зрения оптического микроскопа с фазовоконтрастным устройством при увеличении 80—100. Обычно она наблюдается в 1—2 % слу-

Рис. 35. Суспензия изолированных неисчерченных (гладких) мышечных клеток. Фазовый контраст, X 240 чаев. При просмотре препарата необходимо также обратить внимание на-ннешний вид клеток, степень сокращения, форму (веретенообразные, скрученные и т. п.).

Лабораторная работа № 2.

Определение целостности клеточной мембраны

Ход работы. К суспендированным клеткам добавляется 1 %-й трипановый синий в растворе I и препараты просматривают в микроскопе. Отсутствие окрашивания у 90 % клеток показывает, что практически все клетки хорошо перенесли изолирование.

К капле суспензии под покровное стекло добавляют ацетилхолин различных концентраций (от 10-2 до 10-s М) и с помощью секундомера замеряют время сокращения (обычно 30—80 с). То же самое проделывают о растворами, содержащими различные концентрации ионов Са2+ (0,1—0,6 мМ), К+ (0,05—0,5 м). Экспериментальные данные сводят в таблицу.

Для исследования ультраструктуры изолированных клеток и сравнения ее с таковой интактной ткани используют метод ультратонких срезов. Для этого образцы клеточной суспензии и интактной ткани подготавливают согласно методике, описанной ни

страница 51
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)