Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

имеет прямолинейный характер.

Максимальное разделение достигается при использовании диск-электрофореза в ПААГ. (Название «диск» — от дискретного напряжения электрического поля, что обеспечивается прерывистым градиентом рН в системе.) Суть метода заключается в следующем. В стеклянной вертикальной трубке полимеризуют гель неодинаковой концентрации. Верхняя часть (область образца до 100 мкм толщиной) и средняя (прокладка) имеют меньшую концентрацию, чем нижняя часть — разделяющий гель. Образец наносят на верхнюю часть геля. (Иногда верхний гель не используется. Тогда образец наносят в плотном растворе сахарозы на гель-прокладку под буфере Больший размер пор верхних слоев геля и больший градиент электрического поля (последнее обусловлено низкой ионной силой и градиентом рН) обеспечивают более быстрое движение образца, чем в разделяющем геле, и накопление вещества на верхней границе разделяющего геля. В последнем геле в зависимости от подвижности образуются различные зоны. Затем гель из трубки удаляют и идентифицируют зоны белков (как описано раньше). Следует помнить, что чем больше белков в исследуемом образце, тем больше необходимо наносить белка. На практике при исследовании мембранных белков навеска образца составляет в среднем 100 мкг — 1,0 мг.

Градиент рН используется не только в диск-электрофорезе, но и при электрофорезе с достижением изоэлектрической точки. (Изоэлектрическая точка — значение рН, при котором амфолит (молекулы, содержащие катионные и анионные группы, например, белок) теряет заряд и в электрическом поле не движется.) Если смесь белков разделять электрофоретически в градиенте рН, то каждый белок будет двигаться до достижения своей изоэлектрической точки. В результате отдельные белки как бы «сфокусированы» в отдельных зонах. Поэтому этот метод еще носит название изоэлектрической фокусировки. Он используется не только в аналитических, но и в препаративных целях. Особенно часто он применяется на первых этапах очистки белков, так как позволяет быстро и с высоким разрешением фракционировать довольно большие (граммы) количества образца.

Физические методы. Современные представления о структуре и функциях биологических мембран были сформулированы благодаря широкому применению наряду с другими ряда физических методов исследования. Большинство этих методов вначале было использовано для изучения различных изолированных компонентов биомембран, а также для контроля очистки субклеточных фракций. В последние годы физические методы, главным образом некоторые виды спектроскопии, с успехом применяются в работах, направленных на изучение структурной организации мембран и выяснение механизмов функционирования этих систем.

Исходя из того, что различные вещества могут поглощать и испускать свет, вращать и поглощать плоскополя-ризованный свет, поглощать и отражать рентгеновские лучи, а также исходя из явлений ядерного и электронного магнитного резонансов (ЯМР и ЭПР), использование оптических методов дает возможность изучать структурную и функциональную организацию мембран и их компонентов. С помощью этих методов можно идентифицировать вещество и определить его концентрацию, параметры и ориентацию макромолекул, а также конформационные перестройки в них, локализацию отдельных аминокислот в молекуле белка, комплексообразование, денатурацию, свойства активного центра фермента и роль, например, кофактора в связывании субстрата ферментом, взаимодействие макромолекулы с растворителем, межмолекулярные расстояния и коэффициент вращательной диффузии макромолекул и др.

Спектроскопия в видимой и ультрафиолетовой областях спектра. Как известно, свет представляет собой электромагнитную волну, состоящую из взаимно перпендикулярно осциллирующих (по синусоиде) электрического (Е) и магнитного (Я) полей. При поглощении кванта света с энергией

Е = hv, (33)

где h — постоянная Планка, v — частота электромагнитных колебаний, молекула переходит в возбужденное состояние. (Такие молекулы или их части называются хромофорами.) Наибольшая вероятность поглощения энергии наблюдается тогда, когда количество поглощенной энергии соответствует разности энергий различных энергетических уровней электронов. Зависимость величины поглощенной энергии от длины волны называется спектром поглощения.

Для большинства биологических молекул длины волн, соответствующие энергии перехода между основным состоянием молекулы и колебательными уровнями возбужденного состояния, лежат в ультрафиолетовой и видимой частях спектра. (В результате поглощения излучения инфракрасной области возможны переходы лишь между колебательными уровнями одного энергетического уровня.)

Если мы измеряем поглощение образца, концентрация (С) которого выражена в грамм-молях на литр, а путь прохождения света (d) в сантиметрах, то оптическая плотность (D) будет равна

D = lg-y- = edC, (34)

где /о и / — интенсивность падающего на образец и прошедшего через него света соответственно, е — молярный коэффициент экстинции, или вероятность осуществления электронного типа перехода при данной длине волны. Интенсивность прошедшего через образец света подчиняется закону Ламберта — Бера

/ = /0-10-*dc. , (35)

При регистрации оптической плотности всегда следует помнить, что Я,Шах и е зависят от рН и полярности растворителя. В случае полярных веществ увеличение рН и уменьшение полярности растворителя увеличивает как Я-max, так и е.

Таким образом, под действием электромагнитного излучения в УФ- и видимой областях спектра происходят изменения энергии валентных электронов одинарных и кратных связей (а- и п-электронов), а также электронов непо-деленных электронных пар гетероатомов (га-электроны), входящих в состав образца. Измерение зависимости величины поглощения света от длины волны электромагнитного излучения дает возможность получить спектр поглощения исследуемого образца в ультрафиолетовой (180—400 нм) и видимой (400—600 нм) областях.

Основные компоненты биологических мембран — белки и фосфолипиды — обладают сильным поглощением

страница 40
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.11.2019)