Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

рованный уголь и т. д. Приемы применения адсорбционной хроматографии аналогичны приемам распределительной.

Ионообменная хроматография. Этот вид хроматографии можно считать вариантом адсорбционной хроматографии. Принцип метода состоит в том, что ионо-обменник обратимо адсорбирует заряженные молекулы. Существует два типа ионообменников: катиониты (несут отрицательные заряды, например SO~,-карбоксильные группы) и аниониты (заряд положительный, например, четвертичная аминогруппа, алифатические или ароматические аминогруппы). Матрицы бывают: декстрановые, целлюлозные, акрильные, фенольные, используются смолы «дауэкс» и др. Мембранные белки (как и полисахариды) лучше разделяются на ионообменниках на основе целлюлозы, декстрана и полиакриламида.

Знание общей емкости ионообменника (миллиэквивален-ты обменивающих групп на 1 мг сухого сорбента) очень важно, так как при перегрузке колонки ионы исследуемого образца не будут связываться. Реальная же емкость зависит от условий эксперимента (рН, ионной силы, пористости матрицы, размеров частиц ионообменника, которые обозначают ситовыми размерами—МЕШ). В связи с этим необходимо тщательно выбирать ионообменник и подбирать условия эксперимента. Например, для макромолекул, нестабильных при низкой ионной силе, лучше использовать ионо-обменники типа сефадекса и биогеля. В этих материалах благодаря наличию поперечных связей можно в несколько раз (по сравнению с целлюлозой) увеличить плотность заряда, т. е. увеличить сродство. А это означает, что связывание можно осуществлять при более высокой ионной силе.

Выбор ситового размера представляет непростую задачу. Это связано с тем, что малый размер частиц улучшает разделение, но замедляет скорость тока. Последнее, в связи с диффузионными явлениями, вызывает «размазывание» зон.

При исследовании этим методом необходимо катионные буферы использовать с анионитами, а анионные — с катио-нитами. Ионная сила по возможности не должна быть высокой, а для элюирования необходимо подбирать определенную ионную силу, достаточную для элюирования образца.

Хроматография на молекулярных системах (гель-проникающая хроматография). Хроматография на молекулярных системах дает возможность разделять вещества в широких диапазонах рН, t°, ионной силы и состава буфера. Незначительная адсорбция делает метод особенно ценным при разделении лабильных биологических макромолекул (например, ферментов). Благодаря только этим достоинствам хроматография на молекулярных ситах в основном служит для разделения и очистки в первую очередь белков ;(в том числе и ферментов), а также других составляющих мембраны компонентов. Кроме того, гель-проникающая хроматография с успехом применяется и в аналитических целях.

Суть метода заключается в том, что если пропускать раствор веществ через мелкие частипы инертного материала, то большие молекулы будут двигаться между частицами, а маленькие (диаметр которых меньше или равен диаметру пор в частицах) — диффундировать в частицы, т. е. первыми из раствора пройдут через слой частиц самые большие молекулы, затем—меньше, еще меньше и т. д. Из-за того, что вся система похожа на своеобразное сито, употребляется и соответствующее название.

В качестве молекулярных сит используются гели, которые не взаимодействуют с исследуемыми веществами. Чаще всего применяются декстрановые (сефадексы G—10, G—25, G—75, G—200), агарозные (сефарозы 2В и 4В, биогели А-0,5 М, А-15 М, А-150 М) и полиакриламидные гели (биогели Р-2, Р-6, Р-150, Р-300) для водных растворов, по-листирольные — для неполярных органических растворителей, а оксипропильное производное декстрана — как для полярных, так и для неполярных растворителей. Декстра-новые гели фракционируют вещества, молекулярная масса которых варьирует от 1000 до 800 ООО Д, полиакриламидные — от 200 до 400 000, а агарозные — от 2 000 000 до 150 000 000 Д.

Фирмой ЛКБ (Швеция) предложен новый тип геля — ультрагель. Он представляет собой трехмерную полиакри-ламидную решетку, в промежутках которой находится ага-розный гель. Оптимальный размер частиц ультрагеля составляет от 60 до 140 мкм. Это достаточно маленький размер, чтобы получать высокое разрешение и иметь при этом хорошую скорость потока. Четыре выпускаемых типа ультрагеля (с различными концентрациями полиакрил амида и агарозы) обеспечивают следующие эффективные диапазоны фракционирования веществ с различной молекулярной массой: АсА-54—5 000—70 000 Д, АсА-44 — 10 000— 130 000, АсА-34 — 20 000 — 350 000 и АсА-22 — 100 000 — 1 200 000 Д.

При выборе геля необходимо помнить, что с увеличением размера частиц ускоряется ток исследуемого раствора и, следовательно, ухудшается разрешение метода. Важным является также и то, что практически все используемые гели задерживают соли и небольшие молекулы и что этим методом легко осуществить концентрирование макромолекул. Последнее достигается добавлением к исследуемому раствору сухих гранул геля с порами меньше, чем размеры макромолекул. Сухой гель набухает, поглощая воду, а макромолекулы концентрируются.

Например, для того, чтобы определить молекулярную массу вещества, необходимо построить график зависимости К отlg М.

где Vo — объем растворителя, который необходим для элюирования непроникающих в неподвижную фазу веществ (нулевой, холостой объем); Ve — объем растворителя, требуемого для элюирования исследуемого вещества; Vs — объем неподвижной фазы (разница между общим объемом колонки и нулевым объемом).

Зная эти величины и пропуская через гель несколько веществ с известной молекулярной массой, можно легко определить М исследуемого вещества с точностью ~10 %. При применении же тонкослойной гель-проникающей хроматографии точность определения молекулярной массы

НО

значительно повышается. Последний метод отличается от тонкослойной хроматографии (как типа распределительной хроматографии) тем, что образец наносится на уравновешенный соответствующим растворителем гель, а скорость нисходящего тока жидкости определяется углом наклона пластинки. Этот метод (как

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)