го равновесия. Центрифугирование проводится при такой (низкой) скорости, когда седиментация частицы уравновешивается диффузией. Хоть концентрации вещества вверху пробирки и на дне разные, но значения их всегда постоянны. Такое состояние описывается уравнением Больцмана

_J_ __ е-(?,-Е!)/КГ) (30)

где Ci и С2— концентрации растворенного вещества на расстояниях г\ и г2 от оси вращения; Et и Е2 — потенциальные энергии молекул в точках Сх и С2.

После соответствующей математической обработки получаем уравнение для расчета молекулярной массы

2RT С(г) 1

М =-=-In--,- (31)

(1 —Vp)(oV С (а) г2 —о?

где С(а) и С(г) — концентрации растворенного вещества в области мениска и на расстоянии г от оси вращения.

Строится график зависимости In С(г) от г2, представляющий собой прямую линию, по которой определяют молекулярную массу частиц.

Этот метод очень точный, но требует много времени (равновесие достигается иногда через 24 ч). В связи с этим часто используют быстрый, но менее точный метод Арчибальда. Суть его заключается в том, что измерения концентрации вещества проводятся очень близко к мениску и дну ячейки (что и снижает точность метода). А затем с помощью математических уравнений, используя уменьшение концентрации вещества у мениска и увеличение ее у дна ячейки, определяют молекулярную массу.

Существуют и другие методы определения молекулярной массы. Но так как они редко используются при изучении мембранных систем, мы на них не останавливаемся.

Однако следует иметь в виду, что коэффициент седиментации зависит от нескольких факторов: концентрации раствора, скорости движения частиц, заряда, формы и массы частиц и др.

1. С увеличением концентрации вещества вязкость растворителя вблизи частиц увеличивается. В результате этого скорость движения частицы при ультрацентрифугировании уменьшается.

2. С увеличением скорости движения увеличивается агрегация частиц, что приводит к понижению их эффективной концентрации. 3. Фрагменты и пузырьки мембран, как и их компоненты, в большинстве имеют определенный заряд. Так как коэффициент седиментации для частиц значительно превышает 5 для противоионов, например Na+, К+, Mg2+, то частица движется ко дну центрифужной пробирки быстрее, чем противоионы. Это приводит к возникновению противоположного по направлению седиментации градиента потенциала (он часто называется потенциалом седиментации). Чем больше градиент потенциала, тем меньше величина 5. Если подобные явления нежелательны, их можно избежать увеличением ионной силы раствора, т. е. увеличением концентрации противоионов.

4. Коэффициент седиментации также зависит от формы частицы. Если мы представим себе две фракции мембран: пузырьки и незамкнутые («серповидные») фрагменты, то ясно, что в процессе ультрацентрифугирования пузырьки будут двигаться быстрее. А их константа седиментации будет больше 5 незамкнутых фрагментов.

5. Как видно из уравнения (26), константа седиментации пропорциональна массе частицы только в том случае, если парциальный удельный объем и коэффициент трения не изменяются. '

Таким образом, учитывая кратко изложенные зависимости коэффициента седиментации и то, что эксперименты часто проводятся при разных температурах и различных системах раствор — растворитель, сравнить величины 5, полученные в разных опытах, трудно. (В уравнении (26) температура не вводится, ио необходимо учитывать, что изменение температуры системы изменяет вязкость и плотность раствора, т. е. изменяет члены (1—Vp) и f уравнения.) В связи с этим введено понятие стандартного значения константы седиментации, определяемое в системе,- имеющей вязкость и плотность воды при +20 °С. (Обозначается

Виды ультрацентрифуг. Все отечественные и зарубежные ультрацентрифуги можно разделить на два типа: аналитические и препаративные. Аналитические центрифуги позволяют анализировать распределение вещества в пробирке в течение всего времени. Препаративные, как правило, используются для получения и очистки клеточных органелл и макромолекул, т. е. для получения чистых фракций, препаратов (отсюда название—препаративная). Для беспрерывного наблюдения аналитические центрифуги снабжены оптической системой. При работе на препаративных центрифугах применяют фракционирование содержимого центрифужной пробирки с тем, чтобы в кажРис. 22. Роторы: угловой (а), с подвесными стаканами (б)

дой фракции измерить концентрацию вещества. Таким образом, при необходимости аналитическую центрифугу можно заменить препаративной и наоборот. Поэтому слова «аналитическая» и «препаративная» центрифуга не столько определяют принадлежность прибора к той или иной группе, сколько указывают на наличие или отсутствие специальной оптической системы в нем.

Современные ультра центрифуги работают при ускорениях ~400 000 g, а температура контролируется с точностью до 0,1 °С.

Главным рабочим органом ультрацентрифуги является: ротор. На рис. 22 показаны роторы ультрацентрифуги. УЦП-65. Угловой ротор предназначен для получения плотного осадка на дне центрифужной пробирки. При вращении ротора вещество к стенке пробирки проходит быстро^ (расстояние до стенки значительно меньше расстояния дсг ее дна) и сползает на дно. После остановки вращения ротора пробирки вынимают и, сливая супернатант, получают осадок исследуемого вещества или фракции. Ротор с подвесными стаканами также можно использовать для получения плотного осадка. Однако он чаще используется прн центрифугировании в аналитических целях.

Для измерения концентрации центрифугируемых компонентов (аналитическое центрифугирование) используются три оптические системы.

1. Шлиреновская — луч света отклоняется только в случае прохождения через участок с изменяющейся концентрацией. (Показатель преломления света зависит от концентрации раствора. Эта система используется при концентрациях не ниже десятых долей микрограмма в 1 мл.

2. В связи с недостаточной чувствительностью шлире-новской оптической системы для определения малых изменений концентраций (сот