Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

гналов, несущих информацию об объекте. С помощью соответствующего детектора сигнал преобразуется в электрический и после усиления подается на кинескоп, модулируя интенсивность электронного луча в нем. В результате на экране кинескопа возникает изображение поверхности объекта, соответствующей виду детектируемого сигнала.

Если в световом и просвечивающем электронном микроскопах информацию несет только падающее излучение, то в растровом микроскопе любой сигнал, обусловленный взаимодействием электронного зонда с объектом, может быть использован как источник информации. Другой особенностью растрового электронного микроскопа является последовательный характер поступления информации во времени о каждом элементе поверхности объекта, тогда как в просвечивающем электронном микроскопе информация поступает одновременно от всех элементов.

Поскольку исследование объектов производится в вакууме и они испытывают воздействие электронного зонда, практически невозможно изучать объекты в нативном состоянии.

Предварительная подготовка объекта необходима для придания ему устойчивости к действию повреждающих факторов, но должна оставить в целостности прижизненные морфологические характеристики клеток.

В подготовке к изучению в растровом электронном микроскопе выделяют несколько этапов. Первым является пред-фиксационная обработка, которая сводится к «очистке» поверхности, подлежащей изучению, путем промывки сбалансированными солевыми забуференными растворами. Иногда применяются специальные методы обработки (механическое разделение ферментами и др.) с целью выявления «скрытых» поверхностей. Второй этап обработки — фиксация для сохранения прижизненной структуры клетки. В растровой электронной микроскопии так же, как и в просвечивающей, для фиксации используются альдегиды (глю-таральдегид и формальдегид) и металлы (оксид осмия (VIII)).

После фиксации необходимым этапом является обезвоживание объекта, так как исследование производится в вакууме (при давлении 0,13-10—4—0,13-10-6 кПа или 10~4— 10-6 мм рт. ст.). Обезвоженные в спиртах или ацетоне объекты подвергаются высушиванию. Сейчас в растровом электронном микроскопе используется метод высушивания

4 741 переходом критической точки. Объект, погруженный в ацетон (или спирт), вносят в предварительно охлажденную камеру (+10—15°С), куда из баллона подают С02. Поступая под давлением около 5-880 кПа (60 атм), С02 конденсируется в жидкость, смешиваясь с ацетоном. Постепенно ацетон вытесняется из камеры подачей свежих порций С02 и отведением загрязненных. Затем камеру вновь заполняют свежим С02, герметизируют и нагревают до температуры выше критической (примерно до +42 °С). По мере увеличения температуры возрастает давление в камере. По достижении критической точки жидкий С02 переходит в газообразное состояние. Газ выпускается из камеры, а объект остается высушенным.

Кроме того, применяется метод замораживания — высушивания, который заключается в быстром замораживании биологического объекта с последующей сублимацией льда в условиях высокого вакуума.

Последним этапом в подготовке объекта к изучению в растровом электронном микроскопе является придание ему электропроводности путем покрытия слоем металла. Покрытие должно быть сплошным и равномерным, его обычная толщина равна примерно 10—20 нм. Для создания покрытия используют тяжелые металлы и их сплавы: золото, платину, серебро. Покрытие объекта производится в специальной вакуумной камере и может быть осуществлено двумя способами: путем испарения нагреваемого металла и путем «выбивания» атомов металла, бомбардируемого ионами инертного газа.

С помощью растрового электронного микроскопа можно непосредственно наблюдать характер распределения антигенных участков на поверхности клетки. Для мечения таких участков применяют различные маркеры, с которыми связывают антитела к определенным антигенам. В качестве маркеров используют крупные молекулы, некоторые вирусы и фаги, а также полимерные глобулы и частицы золота. Клетки, фиксированные в суспензии, инкубируют с шариками латекса или шариками, полученными путем полимеризации кремниевой кислоты, предварительно покрытыми адсорбированными на них антителами к определенным антигенам клеточной поверхности. Маркером могут быть и частицы золота, стабилизированные полиэтиленгликолем, обладающие высоким контрастом при наблюдении в растровом электронном микроскопе. Роль маркера могут выполнять также гемоцианин (цилиндрическая молекула размером 20—30 нм) илн ферритин (размер молекулы 10 нм), которые можно связать с антителами к определенным антнгенам клеточной поверхности, используя глютаральдегнд в качестве «сшивающего» агента.

Кроме того, для выявления рецепторов клеточной поверхности применяется метод гибридных антител. Принцип метода состоит в том, что клетки инкубируют с гибридным антителом (специфичным одновременно для антигена клеточной поверхности и для маркера), а затем с маркером; благодаря гибридному антителу осуществляется связь маркера с определенным антигенным участком на наружной мембране клетки. Известен еще ряд методов выявления рецепторов клеточной поверхности. Кроме того, часто применяется различное их сочетание, что позволяет выявлять разные типы рецепторов на поверхности клетки.

Поляризационная микроскопия. С помощью поляризационной оптнкн ультраструктура миелиновых оболочек и других объектов была выявлена задолго до того, как она была изучена в электронном микроскопе. Микроскопические исследования в поляризованном свете производятся с целью изучения оптической анизотропии объектов. Этим методом определяется ориентировка частиц, направление деформаций, величина двойного лучепреломления. В поляризационном, микроскопе перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата н объектива установлены компенсатор и анализатор, служащие для всестороннего изучения лучепреломления в объекте. Изображение препарата рассматривается через окуляр. Анализатор пропускает свет

страница 34
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)