ами белков. При этом альдегиды вступают в соединения с различными функциональными группами белков (в частности, с аминогруппами), во многих случаях образуя между ними связи типа мостиков. В отличие от белков, ненасыщенные липидные компоненты, по-видимому, не стабилизируются альдегидами. Фиксация этих компонентов осуществляется при помощи оксида осмия (VIII), который взаимодействует с липидами по месту двойных связей, образуя эфиры осмиевой кислоты, которые в дальнейшем легко восстанавливаются (рис. 20).

Белки оксидом осмия (VIII) связываются менее эффективно, чем альдегидами. После фиксации объекты подвергаются обезвоживанию, пропитываются акриловыми смолами. В настоящее время используют аралдит, вестопал, этон и другие, благодаря которым повреждения, связанные со сморщиванием, полимеризацией или возгонкой под воздействием пучка электронов, выражены в меньшей степени. При цитохимических электронно-микроскопических исследованиях применяют водорастворимые пластмассы. При полимеризации пластмасс пропитанный ими объект оказывается заключенным в твердый блок, из которого можно приготовить тонкие срезы. Изготавливаются

4н эти срезы при помощи ультрамикротомов, сна--С— бженных стеклянными или алмазными нежась J) • .-

X)s^ Рис. 20. Взаимодействие оксида осмия (VIII) с липи-

ОО Дами ми. Полученные срезы монтируются на сетках с пластинкой-подложкой и подвергаются дополнительному контрастированию с помощью солей тяжелых металлов. Как правило, с этой целью используют соли свинца (например, нитрат свинца) и урана (уранил-ацетат).

Контрастированные срезы изучают в электронном микроскопе, получая изображение на люминесцирующем экране и фотографируют. Мембранные структуры клетки обнаруживают высокую и постоянную осмиофилию.

В последние годы нашел распространение метод приготовления ультратонких срезов без фиксации и заливки тканей в пластмассы. Для этой цели используют криоультра-микротомы, в которых ткань быстро замораживается до температуры жидкого азота ( — 196 °С).

При исследовании молекулярной организации мембран применяют различные модификации метода электронной микроскопии.

Для исследования структуры мембран, находящихся непосредственно в клетке, во фракции изолированных плазматических мембран, а также при исследовании липидных или липидио-белковых искусственных мембран широко используется метод замораживания — травления, предложенный в 1957 г. М. Л. Стиром. Сущность этого метода заключается в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при этой же температуре переносят в вакуумную установку. Там замороженный объект скалывают охлажденным ножом. В вакууме происходит возгонка замороженной воды. Этот процесс называется травлением.

Поверхность скола напыляется углеродом, а затем металлом. Таким образом, получается реплика со скола замороженного объекта. Сам объект удаляют обработкой кислотами, а в электронном микроскопе изучают оставшуюся реплику.

В отличие от обычных методов разобщения тканей на срезы, которые дают возможность видеть поперечные сечения мембраны, реплики с замороженных образцов обнажили большие площадки мембран. Оказалось, что плоскости при скалывании мембран расщепляются вдоль срединного неполярного слоя липидов. Плазмалеммы бактерий и цитоплазматические мембраны дрожжей всегда раскалываются по центру их гидрофобной области, .в то время как область расщепления плазмомембран дрожжевых клеток может, по-видимому, проходить как по центру гидрофобной области, так и по гидрофильным поверхностным областям этих мембран. Для уточнения вопроса о месте раскалывания мембран экстраклеточные и цитоплазматические поверхности плазмалеммы эритроцитов метились фибриллярным антигеном или ферритином. Исследование гидрофильных поверхностей таких «меченых» мембран, обнажающихся после возгонки льда, а также рельефов комплементарных поверхностей (обнажающихся при их раскалывании) позволило сделать вывод, что раскалывание плазмалеммы эритроцитов на «внешнюю» и «цитоплазматическую» половины осуществляется по их центральной гидрофобной области. Таким образом, этот метод позволяет изучить рельеф внутренней поверхности мембран, что недостижимо при использовании других методов. Этот метод показал, что как на поверхности, так и в толще клеточных мембран располагаются многочисленные глобулы (до 3000 на 1 мкм2), их распределение зависит от физиологической активности клетки и условий внешней среды. (Они почти полностью отсутствуют в метаболически инертных мембранах, таких как миелин.) Диаметр этих частиц около 10 нм. По всей вероятности, они имеют белковую природу.

Криоскалывание не разрушает кристаллической структуры липидов, что проверено данными рентгеноструктур-ного анализа. Криоскалывание позволяет также выявлять изменения физического состояния липидов и обнаруживать участки гидрофобных взаимодействий между липидами и другими молекулярными компонентами мембран, в частности, белками.

Применение методов сверхвысоковольтной микроскопии с укоряющим напряжением 1—3 млн. В позволяет получить более высокое разрешение при просматривании более толстых объектов, что дает возможность получить информацию о "трехмерной организации внутриклеточных структур-

Метод растровой (сканирующей) электронной микроскопии. Растровая электронная микроскопия начала использоваться в биологических исследованиях 10—15 лет' тому назад. Этот метод дает универсальную возможность получения объемного изображения объекта в диапазоне увеличений до 100 тыс. при достаточно высоком разрешении. Сейчас оно достигает 3 нМ.

Принцип действия растрового электронного микроскопа состоит в следующем. Электроны, генерируемые пушкой (в результате термоэлектронной или холодной эмиссии), проходят через систему электромагнитных линз, которые фокусируют узкий (диаметр 5—100 нМ) пучок электронов — так называемый электронный зонд — на поверхность исследуемого объекта. В результате взаимодействия электронного зонда с объектом происходит генерирование ряда различных си