Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

технического характера, полностью использовать теоретические возможности разрешения электронного микроскопа не удается. К настоящему времени разрешающая способность электронных микроскопов для серийных приборов достигает 0,5—1,0 нм, для уникальных моделей микроскопов — менее 0,5 нм, а полезное увеличение, получаемое на лучших моделях микроскопов, приближается к миллиону. Это позволяет перейти к изучению структуры мембран на молекулярном уровне.

Промышленность изготавливает электронные микроскопы различных типов: просвечивающие, отражающие, растРис. 19. Электронный микроскоп просвечивающего типа:

/ — катод; 2 — управляющий электрод; 3 — анод; 4 — конденсорная линза; 5 — объективная линза; 6 — апертуриая диафрагма; 7 — селекторная диафрагма; 8 — промежуточная линза; 9 — проекционная Линза; 10 — экран илн фотопластинка; А — В — изображение

ровые и др. Применяются самые различные ускоряющие напряжения — от 15—20 тыс. В до 750 тыс. В и выше. В биологических исследованиях используют главным образом микроскопы просвечивающего типа, с ускоряющим напряжением в пределах 50— 100 кВ.

Конструкция большинства электронных микроскопов основана на одних и тех же общих принципах (рис. 19). Пучок электронов, выпускаемых раскаленной нитью, ускоряется высокой разностью потенциалов между нитью (катодом) и анодом; анод расположен довольно близко от нити и в центре имеет отверстие, через которое проходит пучок. Плотность потока электронов регулируется отрицательным напряжением смещения на фокусирующем электроде, окружающем катод. Одним из основных условий работы микроскопа является стабилизация ускоряющего напряжения. Любые сколько-нибудь заметные флуктуации напряжения приводят к появлению у объективной линзы хроматической аберрации. Линзами, управляющими электронным пучком, могут служить магнитные и электрические поля. В современных микроскопах, дающих высокое разрешение, в качестве линз используются электромагниты с регулируемой напряженностью поля. Пучок электронов фокусируется магнитным полем конденсор-ной линзы и попадает на объект. Увеличение изображения пучка, прошедшего через объект, осуществляется объективной промежуточной и проекционной линзами. Полученное изображение можно визуально наблюдать на флуоресцирующем экране или, заменив экран на фотопластинку, изготовить фотоснимок.

Практически все электроны, идущие сквозь объект, имеют одинаковую скорость, зависящую от общего ускоряющего напряжения и, следовательно, одинаковую длину волны. Поэтому различные участки объекта отличаются исключительно по степени рассеивания электронов и на фотопластинке дают черно-белое изображение. В формировании конечного увеличенного изображения участвуют электроны, прошедшие сквозь объект. Попадая на экран, оии вызывают свечение частиц флуоресцирующего состава либо при замене экрана фотопластинкой возбуждают зерна светочувствительного слоя фотоэмульсии. Электроны, отклонившиеся при встрече с молекулами объекта на достаточно большой угол или потерявшие скорость, в формировании изображения не участвуют. Соответствующие участки изображения на экране остаются темными.

Таким образом, различия в электронной плотности отдельных участков объекта, или разница в контрасте этих участков, зависят от плотности вещества и толщины объекта. Наиболее сильное влияние оказывают вещества, имеющие большую атомную массу, а разность контрастов при этом будет зависеть от различия атомных масс соседствующих в объекте веществ. Последнее обстоятельство объясняет факт малого контраста у биологических объектов, так как большая часть атомов в клетке обладает низкой атрм-ной массой и рассеивает электроны в одинаковой степени.

Беспрепятственное движение электронов в электронном микроскопе возможно только в достаточна высоком вакууме. Созданные экспериментальные модели электронных микроскопов со специальными камерами для живых клеток достаточно удовлетворительных результатов не дали.

Выше мы уже указывали на то, что биологические объекты имеют малый контраст. Его можно повысить, используя тяжелые металлы или их соли. Одним из широко распространенных методов контрастирования мембран является оттенение металлами. В специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла — платины, палладия, их сплавов, урана. Контуры объекта покрываются слоем металлических частиц. Метод дает очень контрастные изображения, но самые тонкие детали получаются размытыми.

При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелых металлов применяют молибдат аммония, уранил-ацетат, фосфорно-вольфрамовую кислоту Суспензированные мембраны смешивают с водными растворами таких веществ, наносят на сетки-подложки и высушивают. Такая обработка создает вокруг них тонкий слой аморфного вещества высокой электронной плотности. В электронном микроскопе они выглядят как светлые объекты на темном фоне (как фотонегатив). Растворенные соли могут проникать в глубь объекта и выявлять дополнительно его детали. Соли тяжелых металлов ясно обозначают контуры мембранных фрагментов и пузырьков. Эта методика более удобна и требует меньше времени, чем позитивное контрастирование, но не дает представления о тонкой структуре мембранной системы. Изучение субмикроскопии клеток в электронном микроскопе затрудняется также их значительной толщиной. Выход из этого положения — приготовление ультратонких срезов очень малой толщины (20—200 нм).

Приготовлению срезов предшествует фиксация тканей, целью которой является сохранение строения структур клетки путем создания новых межмолекулярных связей. В качестве фиксаторов при электронно-микроскопических исследованиях используют растворы глютарового альдегида и четырехокиси осмия в буферах с физиологическими значениями рН. Чаще всего применяется двойная фиксация. Объекты сначала погружаются в глютаровый альдегид, а затем в четырехокись осмия, который как тяжелый металл еще и контрастирует мембраны клеток.

Действие альдегидов и оксида осмия (VIII) сводится к образованию поперечных связей между молекул

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2019)