Биологический каталог




Структура и функции мембран

Автор В.К.Рыбальченко, М.М.Коганов

фадексе. По мере его удаления образуются большие везикулы — до 1 мкм.

Оборудование: ультразвуковой диспергатор УЗДН-1; любой встряхивающий аппарат; набор химической посуды.

Материалы и химреактивы: липиды (индивидуальные или суммарная фракция, выделенная, например, из мозга быка или других тканей); 0,05 М трис-HCl буфер (рН = =7,0); другие растворы неорганических солей, если необходимо изучать проницаемость липосом к этим же ионам. Лабораторная работа № 39. Получение липосом методом ультразвуковой обработки

Ход работы. Сухие липиды растворяют в 2,5 мл 0,05 М трис-HCl буфера (рН=7), встряхивают до получения суспензии. Полученную суспензию фосфолипидов озвучивают в течение 1—5 мин ультразвуковым диепергатором УЗДН-1 на частоте 22 кГц при силе анодного тока 0,4 А. Диспергирование необходимо производить с помощью трубчатого излучателя в пробирке. Для обеспечения акустического контакта между пробиркой, диспергируемым материалом и концентратором в последний наливают определенный объем воды, в который погружается пробирка (для исключения нагревания препарата воду лучше брать холодную иди в смеси со льдом). Проводят озвучивание в заданном режиме.

Форму и размеры липосом определяют методом негативного контрастирования (см. 3.11) и используют в исследованиях процессов Слияния и реконструкции мембранных систем (см. 3.21).

Контрольные вопросы и задания

1. Назовите свойства липосом как моделей биологических мембран. 2. Какова проницаемость липосом к катионам и анионам? 3. Расскажите об использовании липосом в науке и практике.

3.21. ИССЛЕДОВАНИЕ СЛИЯНИЯ И РЕКОНСТРУКЦИИ МЕМБРАН

Как уже указывалось (см. 3.18), взаимодействие моно-слойных структур с везикулами биологических мембран отражает лишь отдельные особенности — поверхностные свойства мембранных структур.

Многогранную информацию о механизмах функционирования различных структур и компонентов биологических мембран можно получить в результате исследований взаимодействия биологических мембран (и их компонентов) с искусственными — липосомами и плоскими липидными би-слойными мембранами (БЛМ). При имплантации в эти искусственные мембраны везикул, например, плазматической мембраны должны резко изменяться не только упорядоченность липидных компонентов, но и липидное микро-окружениё мембранно-связанных ферментов. А это очень важно, так как из опытов по реактивации и реконструкции индивидуальных мембранных ферментов следует, что для оптимизации ферментативных процессов необходимы определенные липиды. Интеграция искусственной и биологической мембран приводит к дестабилизации упаковки липидов (см. 2.5). Это является важным как для формирования функционально активных комплексов искусственная мембрана — нативная мембрана, так и для взаимодействия липосом с биологическими мембранами.

Особенность такого подхода в том, что выделение индивидуальных компонентов белково-липидной природы необязательно. О перспективности такого подхода свидетельствуют успешные попытки интеграции с искусственными мембранами различных типов возбудимых мембран: аксональ-ной мембраны, плазматической мембраны неисчерченных мышечных клеток, а также саркоплазматического ретикулума, мембран эритроцитов и др.

Оборудование: то же, что и для лабораторной работы ЗЛ1 (для исследований методом негативного контрастирования), а также оборудование для получения.БЛМ и липосом (3.19—3.20) и оборудование для исследований АТФ-азных реакций плазматических мембран (3.15).

Материалы и химреактивы: азолектин для получения липосом; выделенная фракция плазматических мембран; среды для определения АТФ-азных активностей; протеолипосомы, полученные из азолектина и плазматических мембран неисчерченных мышечных клеток, а также реактивы,, указанные в 3.19: тетродоксин, тетраэтиламмоний, ве-рапамил.

Лабораторная работа № 40. Получение протеолипосом из везикул плазматической мембраиы

Ход работы. Полученные липосомы из азолектина инкубируют совместно с фракцией плазматических мембран при температуре 37 °С несколько минут. Затем инкубационную смесь (соотношение липид — мембранный белок 6:1) разделяют на три части, с которыми проводят следующие эксперименты.

Одну часть контрастируют, как описано в 3.11, и исследуют форму и размеры везикул «протеолипсом». Затем сравнивают по электронно-микроскопическим фотографиям распределение исходных мембранных частиц {липосом и плазматических мембран) с везикулами, полученными в результате инкубации. Если распределение частиц интегральной суспензии по размерам отличается от аналогичных характеристик как азолектиновых липосом, так и йсРис. 109. Распределение мембранных частиц по размерам для липосом (а), плазматических мембран (б), протеолнпосом (в).

Штриховая линия — распределение частиц, построенное на допущении, что при инкубации плазматических мембран и липосом никаких морфологических изменений ие произойдет; N — частота встречаемости частиц определенного размера

ходной мембранной фракции (как это видно на рис. 109), можно делать заключение, что произошла имплантация нативных мембран в искусственные.

Для определения достоверности полученных результатов рассчитывают кривые распределения по размерам липосомальных, мембранных и интегральных частиц методом среднеквадратичных отклонений. Для этого используют уравнение Гаусса — Лапласа: (1-М)

— е 2°2 (71) г

где f — частота распределения частиц; х — наблюдаемые размеры везикул; М — среднее значение наблюдаемых величин; а — среднее квадратичное отклонение. Строят график зависимости f(x) от X.

Другую часть проинкубированных с азолектиновыми липосомами везикул плазматической мембраны используют для определения АТФ-азных активностей. Это связано с тем, что в указанных соотношениях (6:1) азолектин активирует мембранные АТФ-азы. В данной части работы как тест на получение протеолнпосом можно использовать общую АТФ-азную активность. Можно также использовать АТФ-азные активности, активируемые ионами Na+ и К+, tAg3* и Са2*. Все эти активности при действии экзогенного

страница 100
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109

Скачать книгу "Структура и функции мембран" (2.22Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2019)