зы представляет область на поверхности белковой глобулы, расположенной с дистальной стороны гемина, образованной из спиралей А, В, С, D (рис. 4, б). Активную роль в каталитическом процессе пероксидазного

зо

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

Рис. 4. Модель активного центра (a) [Veitch et al., 1992] и модельная структура пероксидазы хрена (б) (показаны участки, структурно-сходные с ауксин-связывающими белками (черным цветом), а-спирали А, В, С, D, Н и I, гем и остатокТф-117[Савиц-

кийидр., 1998]).

окисления субстратов принимает участие Fe3+, координирующий с четырьмя атомами азотов пирролов протопорфирина, проксимальным лигандом которого является остаток имидазола гистидина белка (His-170). Шестым лигандом является молекула воды. В процессе восстановления перекиси водорода участвуют His-42 и Arg-38, расположенные в спирали В [Schuller et al., 1996; Gajhede et all., 1996; Аммосова и др., 1997; Газарян и др., 1998].

В координации гемина принимают участие остатки фенила-ланинов (Phe-41 и Phe-143), роль которых заключается в формировании гидрофобного окружения нековалентно связанного гемина и обеспечение его прочного встраивания в белковую глобулу [Газарян и др., 1995].

Субстратсвязывающая площадка для соединений органической природы представлена протяженной гидрофобной областью, включающей Arg-38, Phe-142, Phe-143 (рис. 4, о). Местом связывания для оксидазных субстратов пероксидазы, в частности ИУК, может быть дистальный субдомен (рис. 4, б), включающий спирали А (целиком), В (середина), С (начало), D (целиком) и переход спирали D к D' [Упоров, Егоров, 1997; Савицкий и др., 1998].

31

Глава II

2.2. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ

Пероксидаза способна катализировать реакции оксидазного, пероксидазного и оксигеназного окисления субстратов (рис. 5). Не обладая специфичностью в реакциях индивидуального пероксидазного окисления, фермент способен приобретать избирательность в реакциях совместного окисления субстратов. Хотя участие фермента в оксигеназных реакциях мало исследовано.

Наличие у фермента двух различных функций (оксидазной и пероксидазной) позволяет предположить, что в каталитическом действии фермента могут принимать участие два независимых активных центра пероксидазы, пространственно разделенных, хотя и близко расположенных друг от друга на молекуле фермента [Gibson, Lin, 1978]. Такая полифункциональность пероксидазы модулируется ионами металлов и состоянием микросреды вблизи молекулы [Bakardjieva, 1986; Pang et al., 1989]. При этом идентификация пероксидазного и оксидазного участков фермента затруднена из-за недостаточности количественных данных о деталях структуры пероксидазы и ее молекулярной неоднородности [Андреева, 1988].

Широкое распространение пероксидазы в растительных и животных тканях позволяет говорить, что этот фермент выполняет

Пероксидазный ката.из

Оксигеназные реакции

Реакции оксидазного окисления

Реакции индивидуального окисления субстратов

Реакции с медленно окисляемыми субстратами

Доноры электронов

Реакции пероксидазного окисления

Реакции совместного окисления субстратов

Реакции с быстро окисляемыми субстратами

Доноры водорода

Рис. 5. Каталитические свойства пероксидазы. 32

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

многогранную работу в биогенных системах. Поэтому исследование структуры и механизма действия пероксидазы представляет не только теоретический интерес для понимания физиологической роли и принципов функционирования фермента, но и имеет важное практическое значение, поскольку пероксидаза широко используется в аналитических исследованиях [Угарова и др., 1981]. Поэтому мы рассмотрели механизм действия пероксидазы как в оксидазных, так и в пероксидазных реакциях окисления субстратов.

2.2.1. ПЕРОКСИДАЗА В РЕАКЦИЯХ ОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ СУБСТРАТОВ

Приоритет в открытии оксидазной функции пероксидазы принадлежит Теореллю [Swedin, Theorell, 1940], который обнаружил в растениях фермент, окисляющий дигидроксифумаровую кислоту с поглощением кислорода и доказал, что этот фермент — пероксидаза. Оксидазными субстратами пероксидазы могут быть гидро-, нафтохиноны, индолилуксусная кислота, НАДН2, НАДФН2, флороглюцин, диоксифумаровая кислота, глютатион и др. [Иванова, Рубин, 1962, 1963; Piette, 1963; Klapper, Hackett, 1963, 1965; Рубин, 1966; Yamazaki, Kay et al., 1967; Рамазанова и др., 1971; Березин и др., 19756; Srivastava, Huystee, 1977].

Особенностью механизма действия пероксидазы в оксидазных реакциях является способность фермента в процессе каталитической реакции генерировать свободные радикалы: 02, НО'2 и радикал органического субстрата. Типичным субстратом в оксидазных реакциях пероксидазы является диоксифумаровая кислота [Saunders et al., 1964]. Оксидазное окисление ДФК исследовал Чане, используя метод остановленной струи при рН 4 [Chance, 1952]. Было показано, что для проведения реакции при 4 "С требовалось присутствие ионов марганца, однако повышение температуры способствовало протеканию реакции и в отсутствие ионов марганца. Для пероксидазы, активированной ионами марганца, Чане определил константу взаимодействия с кислородом (106 М~'сек-1), и показал, что образующийся комплекс ПО-02ре-агирует с ДФК, с константой равной 4 • 105 М-,сек~'.

В работе [Березин и др., 19756] показано, что автокаталитический характер оксидазного окисления ДФК обусловлен образованием в ходе реакции Н202 и других соединений типа гидроперекисей. Активной промежуточной формой пероксидазы, которая

33

Глава II

накапливается в достаточно большой концентрации, является соединение III. Предложена следующая схема реакций.

Е + 02 + ДН2 —> Е-02 + ДН- + Н+ Е-02 + ДН2 + Н+ -> Е + ДН- + Н202 ДН- + о2 -» НДОО-Е-02 + ДН¦ + Н+ -> Е + Д + Н202

Кислород может участвовать не только в ферментативной реакции, но и в реакции с радикалами субстрата. Последняя приводит к образованию гидроперекисного радикала, который далее превращается в молекулу гидроперекиси при отрыве водорода от молекулы субстрата. Образующаяся в реакции перекись водорода и гидроперекиси являются субстратами пероксидазы. Реакция их с ферментом приводит к образованию соединения I, которое далее взаимодействует с субстратом ДФК, инициирует образование дополнительных количеств радикалов ДН- в системе и способствует увеличению скорости окисления ДФК. При высоких концентрациях пероксидазы отмечается значительное возрастание скорости инициирования свободных радикалов. При этом увеличивается вероятность взаимодействия промежуточного соединения III со свободными радикалами. Эта реакция может быть причиной отклонения от линейной зависимости между скоростью реакции окисления ДФК и концентрацией пероксидазы, что отмечалось при высоких концентрациях фермента [Березин и др., 19756].

Рост и развитие растений стимулируется с помощью гормонов, среди которых наиболее важным является ИУК [Полевой, 1989; Гамбург и др., 1990]. Ауксин может подвергаться окислению кислородом, которое катализируется пероксидазой [Siegel, Galston, 1967; Sahulka, 1970; Saijo, Takeo, 19