Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

тодом рентгеноструктуриого анализа (РСА) разрешены третичные структуры некоторых пероксидаз — цитохром С пероксидазы из дрожжей [Poulosetall., 1987], грибной пероксидазы [Kurishimaetal., 1994], марганцевой пероксидазы [Sundaramoorthy et al., 1994], пероксидазы арахиса [Schuller et al., 1996]. Для изофермента С пероксидазы хрена также установлена пространственная третичная структура фермента методом РСА с разрешением около 2 А [Gajhede et al., 1996], однако координаты атомов этого белка до сих пор закрыты для пользователей. Поэтому построение модели активного центра пероксидазы хрена основано на гомологии с первичной последовательностью пероксидазы арахиса, имеющей высокую степень сходства в строении третичной структуры и координаты которой открыты для доступа. Причем степень идентичности аминокислотных последовательностей этих ферментов превышает 50%. Используя такую высокую гомоло-гичность, в работе [Упоров, Егоров, 1997] построили модель пространственной структуры пероксидазы хрена, которая предполагает в основном такой же фолдинг, как и пероксидаза арахиса: 10 а-спиралей A-J (рис. 2). В спирализованные участки белковой молекулы входят аминокислотные остатки с номерами полипептидной цепи: А спираль — 14-28, В спираль — 31-45, С спираль — 76-90 и D спираль — 92-112. Третичная структура фермента скрепляется четырьмя дисульфидными мостиками между аминокис-

26

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

Рис. 2. Кристаллическая структура пероксидазы арахиса [Schuller et al., 1998]. Показаны дистальные остатки His-42, Arg-38, Phe-41, проксимальный His-169, координирующий гем в активном центре пероксидазы, Phe-142, Phe-143 на входе в активный центр.

лотными остатками: 11-91, 44-49, 97-301 и 177-209, которые расположены внутри молекулы. Центры гликозилирования пероксидазы хрена расположены на поверхности белка и доступны для формирования комплекса с углеводами, которые включают аминокислотные последовательности состава Asp-X-Ser/Thr с номе-

27

Глава II

рами 13-15, 57-59, 158-160, 186-188, 198-200, 214-216, 255-257 и 268-270. Молекула пероксидазы содержит восемь олигосахаридных цепочек.

Высказано предположение, что два иона Са2+, участвующие в стабилизации трехмерной структуры молекулы пероксидазы хрена, координируют с аминокислотными остатками (43, 46, 48, 50, 64) и (171, 222, 225, 228, 230); в координации железа гемина (Phe-41, Phe-152, His-170, Leu-250) и в связывании ароматических субстратов (Ile-180, Phe-221, Пе-244). Активный центр фермента представлен Arg-38, Phe-41, His-42. В дистальной области гемо-вого кармана находятся две молекулы воды [Gajhede et al., 1996].

Одним из новых подходов к изучению линейных антигенных детерминант является антигенное картирование белков методом пептидного сканирования (PEPSCAN). Суть этого метода заключается в синтезе коротких перекрывающихся олигопеп-тидов — фрагментов аминокислотной последовательности изучаемого белка и их тестирование с помощью иммунофермент-ного анализа на взаимодействие с поликлональными антителами [Аммосова и др., 1997]. Непрерывные или линейные антигенные детерминанты представляют собой непрерывный участок полипептидной цепи, и конформационные антигенные детерминанты состоят из аминокислот, но сближенных в пространстве и не обязательно связанных пептидной связью [Максютов, Загребельный, 1993].

Используя этот метод были определены линейные антигенные детерминанты изофермента С пероксидазы хрена (рис. 3) [Аммосова и др., 1997]. Показано, что линейные антигенные детерминанты фермента, некоторые из которых пространственно локализованы в регулярных элементах вторичной структуры а-спиралях, расположены как с наружи, так и внутри белковой глобулы. Часть эпитопов локализована в петлях и изгибах пептидной цепи пероксидазы, обладает «нерегулярной» конфор-мацией. В составе полученных антигенных детерминант наиболее часто встречались десять аминокислот — Arg, Ser, Ala, Thr, Leu, lie, Val, Phe, Pro, Asn. В состав эпитопов входили заряженные аминокислоты Arg и Asp, неполярные аминокислоты Ala, Leu, Не, Val, Phe, Pro и Trp и незаряженные полярные аминокислоты — Asn, Thr, Ser, Gin, Tyr, Gly (составляющие 13,4, 51,2 и 35,4% соответственно от общего состава детерминант). Таким образом, на поверхности белковой глобулы фермента преиму-

28

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

Рис.3. Схематический вид эпитопов HRPC. Участки полипептидной цепи, входящие в эпитопы, представлены в виде затемненных сплошных лент. Также на рисунке изображены гем и аминокислотные остатки, входящие в активный центр; ионы кальция (в виде шариков) и дисульфидные связи (в виде цилиндров) [Аммо-

соваидр., 1997].

щественно располагаются гидрофобные аминокислотные остатки. Три из восьми пептидов, гликозилированные в нативной молекуле пероксидазы хрена (13-15, 198-200, 268-270), входили в состав эпитопов, остальные же гликозилированные амино-

29

Глава II

кислотные остатки были расположены достаточно далеко от антигенных областей. Выявленные эпитопы содержали несколько функционально важных остатков: Arg-38, входящий в активный центр пероксидазы хрена и Phe-142, Phe-143, формирующие канал доступа ароматических субстратов к активному центру фермента. Большая часть аминокислотных остатков, участвующих в связывании кальция, в координации железа гемина и в образовании субстратсвязывающего участка, не входили в состав антигенных детерминант, что согласуется с предположениями о том, что эти участки являются консервативными и стабильными структурами [Welinder, 1985], расположенными внутри белковой глобулы.

Используя методику ренатурации рекомбинантной пероксидазы хрена, были получены формы фермента с точечными мутациями F41H и Н143Е [Газарян и др., 1995]. При этом известно, что Phe-41 локализован между остатками дистальных His-40 и His-42. Последний координирует атом железа гемина в активном центре пероксидазы хрена. Тогда как, остаток Phe-143 расположен в проксимальной области гемина вблизи входа в гемсвязывающую полость и совместно с Phe-142, способен формировать субстрат-связывающий участок активного центра пероксидазы. Данные мутации приводили к падению удельной ферментативной активности более чем в 40 раз, с проявлением влияния на различные стадии каталитического механизма. Замена F41H вызывала понижение каталитической константы скорости по перекиси водорода на два порядка и на один порядок по АБТС. При окислении иодида мутация приводила к смене каталитического механизма. Тогда как замена Н143Е влияла преимущественно на стадию окисления АБТС и отщепление продукта его окисления. При этом в реакции окисления иодида данный мутант имел на порядок меньшие константы скорости как по перекиси водорода, так и по иодиду. На основании проведенных исследований высказаны предположения, что роль замещенных остатков фенилаланинов (Phe-41 и Phe-143) состоит в формировании гидрофобной полости, обеспечивающей прочное нековалентное связывание порфиринового цикла гемина (рис. 4, а) [Газарян и др., 1995].

Таким образом, активный центр пероксида

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.06.2019)