действий пиррольных колец протопорфирина с аминокислотными остатками, главным образом с остатком тирозина, фенилаланина, триптофана, гистидина и метионина. Используя замещенные гемины, с этери-фицированными карбоксильными группами в 6 и 7 положениях, было показано, что реконструированные ферменты реагируют с перекисью водорода с образованием промежуточного соединения Е, с теми же скоростями, как и нативная пероксидаза [Araiso et al., 1979; Araiso, Dunford, 1981]. Авторами было высказано предположение, что карбоксильные группы пропионовокислых остатков гемина не играют роли в образовании соединения Е, пероксидазы. Однако в работе [DiNello, Dolphin, 1981] показано, что даже незначительные изменения структуры заместителей в 6 и 7 положениях резко уменьшает скорость связывания модифицированных геминов с апопероксидазой и активность реконструированных ферментов. По-видимому, пропионовокислые остатки гемина участвуют в его связывании с белком и важны для правильной ориентации гема на белке и поддержании активной нативной структуры фермента.

Комплексообразование апопероксидазы с гемином резко повышает устойчивость фермента к действию УФ-облучения и температуры. Удаление гемина приводит к потере пероксидазной активности, но не сказывается на ее оксидазной функции [Siegel, Galston, 1967; Березин и др., 1975а].

Нативный фермент имеет в составе нейтральные и аминосаха-ра в количестве до 20% общего веса [Shannon et al., 1966]. Молекулы Сахаров могут присоединяться только к пяти аминокислотным остаткам из тех двадцати, которые входят в состав полипептидной цепи [Sharon, 1974]. Углеводные цепи предохраняют фермент от инактивации радикалами, образующимися в ходе реакций, и уве-

23

Глава II

личивают термическую стабильность пероксидазы. Удаление углеводов хотя и не влияет на каталитическую активность фермента, однако приводит к ускорению его инактивации в ходе реакции [Клячко, 1997].

В составе полипептидных цепей пероксидаз содержится от 6 до 8 SH-групп, которые связаны в 3-4 дисульфидные связи [Shin et al., 1971]. В состав молекулы пероксидазы включены два иона кальция, которые мало влияют на каталитическую активность, однако необходимы для поддержания высокой термической стабильности фермента [Haschke, Friedhoff, 1978; Ogawa et al., 1979].

Известно, что белки являются амфотерными полиэлектролитами, т.е. сочетают в себе кислотные и основные свойства. Кислотные свойства белку придают кислые аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая), а щелочные свойства — основные аминокислоты (лизин, аргинин, гйстидин). Чем больше кислых аминокислот содержится в белке, тем ярче выражены его кислотные свойства, и чем больше входит в состав белков основных аминокислот, тем сильнее проявляются его основные свойства. Причем pi каждого белка определяется соотношением кислых и основных групп боковых радикалов аминокислот: чем выше соотношение кислые/основные аминокислоты в белке, тем ниже его изоэлектрическая точка [Строев, 1986]. Нами проведена оценка содержания заряженных аминокислот в различных изоферментах (А,, В и С) пероксидазы (табл. 3). Видно, что в составе полипептидной цепи фермента содержится всего от 22 до 26% заряженных аминокислот. Таким образом, 3/4 части полипептидной цепи пероксидазы представлены гидрофобными и незаряженными аминокислотами. Наличие высокой степени гидрофобности белковой молекулы позволяют предположить, что пероксидаза может являться мембранным ферментом, что и было доказано изучая каталитическую активность пероксидазы в системах обращенных мицелл, в том числе и АОТ [Клячко, 1990; Клячко и др., 1997]. В экспериментах использовались нативная и рекомбинантная пероксидазы. Последняя не содержала углеводных остатков на поверхности белковой молекулы. Показано, что стабильность фермента зависит от степени гидратации ПАВ (wo= [Н20]/[АОТ]). В экспериментах использовались два подхода нековалентной модификации микросреды внутренней полости мицеллы. Во-первых, в водный буферный раствор, солюбилизируемый обращенными

24

Пероксидаза — катализатор биогенных систем

Таблица 3

Состав аминокислот, входящих в первичную структуру изоферментов пероксидазы, ' и их некоторые физико-химические свойства [Delincce, Radola, 1970; Phelps et al., 1971; Shih et al., 1971; Welinder, Mazza, 1977; Welinder, 1979]

g я o Аминокислоты (%) ^ а>

g я его КИСЛ i a a> Я заряженные р! »х а> 3 ?

Изофе] перою Be амино ° а X ПОЛЯР! всего положительно отрицательно Кис. осно

HRP-A, 267 104 104 59 14 45 3,6-4,2 3,2

(100) (39) (39) (22) (5) (17)

HRP-B 300 129 92 79 29 50 8,7 1,7

(100) (43) (31) (26) (9) (17)

HRP-C 308 130 99 79 30 49 9,0 1,6

(100) (42) (32) (25) (10) (16)

мицеллами, была внесена глюкоза. Оказалось, что добавление 10%-ной глюкозы не приводило к изменению стабильности реконструированной пероксидазы при степени гидратации 10. Отсутствие стабилизирующего эффекта было объяснено тем, что размеры внутренней полости мицеллы и белка при этой степени гидратации совпадают и, по-видимому, вода вместе с растворенными в ней низкомолекулярными компонентами оказывается вытесненной из внутренней полости в район первых СН2-групп углеводородных остатков ПАВ.

Для реализации второго подхода были использованы ПАВ твин и спан, содержащие в своем составе сорбитовое кольцо. Введение 1 мМ (1% относительно концентрации АОТ) спана 80 приводило к достижению стабильности, характерной для нативной пероксидазы хрена в тех же условиях [Клячко и др., 1997].

На основании полученных данных было высказано предположение, что повышение активности и стабилизирующий эффект нативной пероксидазы в растворах ПАВ [Левашов, 1987], по-видимому, обусловлены наличием на поверхности белковой глобулы фермента углеводных фрагментов, ковалентно связанных с белком, содержащих галактозу, глюкозу, арабинозу, фруктозу, глюкозамин, маннозу, ксилозу и фукозу [Юаррег, Hackett, 1965; Андреева, 1988]. Эти углеводные фрагменты на поверхно-

25

Глава II

сти белковой молекулы могут быть использованы при связывании пероксидазы с углеводами клеток. Так, показано сродство одной из пероксидаз — перонектина к фибронектину — одному из углеводсвязывающих белков — лектинов [Johansson, 1997]. При этом растительные пектинсвязывающие белки иммунохимиче-ски сходны с витронектином и некоторые из них являются пе-роксидазами. Кроме этого пероксидаза хрена способна связываться с поперечно сшитой агарозой [Lascu et al., 1986]. Выявлена высокая специфичность в связывании анионных пероксидаз корней пшеницы к хитину, полимеру N-ацетил-О-глюкозами-на, входящего в состав клеточной стенки грибов, что может реализоваться в защитной роли этих изоформ пероксидазы в растениях при грибной инфекции [Максимов, 1994; Максимов и др., 1995].

Для полного понимания механизмов функционирования пероксидаз необходимо знание их пространственной структуры [Упоров, Егоров, 1997]. К настоящему времени ме