я в «кармане» между двумя закрученными областями белковой глобулы, граничащими с двумя спиральными участками [Poulus et al., 1980]. «Карман» окружен алифатическими и ароматическими аминокислотными остатками, некоторые из которых находятся в контакте с гемовой группой. Гем удерживается в этом «кармане» за счет образования водородной связи между одной из пропионовокислых групп гема с треонином полипептидного участка, принадлежащего одной из антипараллельных (3 пар.

Направленность к поверхности белка карбоксильных групп гема наблюдается не во всех гембелках. Так, согласно результатам рентгеноструктурного анализа, у феррицитохрома с лошади они расположены на дне расщелины, образуемой полипептидной цепью, в которую упакован гем, и связаны водородными связями с аминокислотными остатками белка [Dickerson et al., 1971]. Одна из двух пропионовокислых групп цитохрома с более глубоко погружена в белковую глобулу и связана с водородными связями с тремя остатками: Туг-48, Тгр-59, Thr-40, а другая, расположенная ближе к поверхности молекулы, образует водородные связи с остатками Thr-49 или Asn-52.

В гемоглобине, миоглобине, цитохром с пероксидазе и пероксидазе хрена гем нековалентно связан с апобелком и его можно обратимо удалить [Maehly, 1952; Amiconi et al., 1972]. После реконструкции фермента полностью восстанавливается его каталитическая активность. Однако в случае каталазы это не удавалось сделать, что можно было объяснить несколько иным положением гемина на апобелке. Результаты рентгеноструктурного исследования каталазы показали, что гем глубоко погружен внутрь глобулы почти на 20 А от поверхности белка и расположен в гидрофобном «кармане», который образован аминокислотными остатками двух различных субъединиц. Каждая из пропио-новых кислот гема связана, как и в цитохроме с, водородными связями: одна — с Arg-71 и Arg- 111, а другая образует связь с His-361 и Arg-364 [Murthy et al., 1981]. Рентгеноструктурные исследования большинства гембелков, как было показано выше, убедительно показывают, что пропионовокислые остатки гема в гембелках образуют водородные связи с аминокислотными ос-

16

Гемсодержащие белки, катализирующие пероксидазные реакции

татками полипептидной цепи. Поэтому трудно предположить чтобы они могли участвовать каким-то образом в каталитическом процессе. Однако данные рентгенографического исследования позволяют определять положение аминокислотных остатков только в статическом состоянии, поэтому их недостаточно для точного определения функциональной роли пропионовокислых остатков гема.

Одним из способов выявления роли карбоксильных групп в катализе является изучение свойств реконструированных гембелков с этерифицированными пропионовокислыми остатками гема. Однако такие исследования часто вносят путаницу, так как правильный ответ может быть получен только в том случае, если при реконструкции апобелка с модифицированным гемом образуется каталитически активная конформация нативного белка. Однако достичь этого очень трудно, т.к. при использовании модифицированных гемов часто нарушается структура активного центра фермента вследствие неправильной ориентации гема на апобелке. Этого можно избежать, если модифицировать пропи-оновокислые остатки гема непосредственно в нативном ферменте, выделить модифицированный гем, а затем проводить реконструкцию модифицированного гема с нативным апобелком и исследовать влияние модификации на каталитические свойства фермента. Таким способом можно определить число доступных модифицирующим агентам, т.е. расположенных близко к поверхности карбоксильных групп гема, и избирательно промодифи-цировать их как в 6-ом, так и 7-ом положениях, которые, по-видимому, в общем случае не эквивалентны.

1.3. УЧАСТИЕ ГЕМИНА В КАТАЛИТИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ ГЕМСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ

Каталитически активной группой, входящей в состав активного центра пероксидазы, каталазы и цитохром с пероксидазы, является гемин, содержащий трехвалентное железо. Поэтому данные ферменты могут катализировать пероксидазные процессы окисления. Реакция этих гембелков с перекисью водорода идет через образование нескольких промежуточных соединений, которые спектрально сходны и имеют близкие максимумы поглощения (табл. 2). Однако исследование этих промежуточных соединений методами ЭПР и ЭЯДР [Hanson et al., 1981; Blumberg,

17

Глава!

Таблица 2

Максимумы поглощения и значения молярных коэффициентов поглощения пероксидазы, каталазы, цитохром с пероксидазы и их промежуточных соединений с перекисью водорода

Фермент и его промежуточные

Максимумы поглощения, нм (е,мМ'см~')

формы полоса Соре видимая область

Пероксидаза хрена 403(102) 498, 640 (11,25) (3,23) Schonbaum, Lo, 1972

Е, 400(53,8) 525, 577,622,651

Е, 420(105) 527, 554(9,5) (9,65)

Е, 416 546, 583, 673 Keilin, Hartree, 1951

Каталаза печени лошади 405(140) 506 пл, 544 пл, 629 Keilin, Hartree, 1951

Е, 405 (30) 670

Е, 410(26) 536, 572

Е, 416 545, 585

Цитохром с пероксидаза 408 (93) 505, 535 пл, 645 Yonetani, 1970

Е, 420 530, 561,625 Yonetani, Asakura,1968

Литература

Peisach, 1968; Hoffman et al., 1981] показало, что их электронные структуры имеют как общие черты, так и различия. Для каталазы и пероксидазы перекись водорода является субстратом. Каталаза реагирует с перекисью с образованием трех соединений [Keilin, Hartree, 1951]. Лишь одно из них, соединение I, аналогично соединению I пероксидазы с Н202, обладает высокой каталитической активностью и участвует в окислении различных органических соединений. Соединение II каталазы образуется только при действии избытка перекиси; его каталитическая активность приблизительно в 104 раз меньше, чем активность соединения I. Кейлин и Харти [Keilin, Hartree, 1951] обнаружили еще неактивное соединение III, образующееся в присутствии высоких концентраций перекиси водорода (табл. 2). Реакция каталазы с перекисью водорода отличается от аналогичной реакции пероксидазы. Каталаза осуществляет реакцию диспропорционирования, т.е. расщепляет перекись водорода до воды и 02 в ходе одностадийной двухэлектронной реакции по схеме [Hanson et al., 1981]:

КАТ + Н202 —> соединение I + Н20 Соединение 1 +Н202 —> КАТ + Н20 +02

18

Гемсодержащие белки, катализирующие пероксидазные реакции

Пероксидаза катализирует реакцию восстановления перекиси водорода до воды с образованием двух промежуточных соединений Е, и Е2, причем процесс происходит в две последовательные одноэлектронные стадии [Chance, 1952].

В настоящее время считается доказанным, что соединение Е, каталазы и пероксидазы содержат по два окислительных эквивалента: один на железе гема, имеющего электронную конфигурацию Fe (IV), а другой в виде л-катион радикала на порфирине [Hanson et al., 1981]. В работе [Browett, Stillman, 1981] была предложена электронная структура соединения Е, отражающая механизм действия пероксидазы, в которой соединение Е1 существует в виде 0 = Fe (IV) (феррильная конфигурация), а соединение Е2 в форме ОН — Fe (IV). Однак