ношению к природе окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, на протекание которых могут оказывать влияние присутствующие в среде активаторы или ингибиторы фермента. Так, например, изучение пероксидазных реакций окисления о-дианизидина и гидрохинона в присутствии индолил-3-уксусной кислоты позволило установить индивидуальные участки связывания этих субстратов и ингибитора в активном центре пероксидазы, поскольку место связывания ИУК на поверхности белковой глобулы было изучено методом антигенного картирования [Аммосова и др., 1997].

В реакции окисления о-дианизидина в присутствии ИУК проявляемый конкурентный тип ингибирования свидетельствовал о том, что о-дианизидин и индолил-3-уксусная кислота связываются в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствовало как связыванию, так и превращению о-дианизидина (рис. 59). Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связывались в различных местах активного центра, однако, если индолил-3-уксус-ная кислота связывалась на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становилось невозможным. Это может наблюдаться вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора, или наличием регуляторного участка на поверхности белковой глобулы (рис. 59). Причем при рН 4,5—6,5 тип ингибирования ИУК пероксидазы в реакции окисления гидрохинона неконкурентный, однако при увеличении рН он меняется и становиться смешанным. При этом ухудшалось связывание субстрата, т.е. при наличии ИУК происходит понижение сродства гидрохинона к активному центру фермента. Однако, если все-таки гидрохинон связался в активном центре, то дальнейшее его превращение ухудшалось. Причем связывание ИУК с пероксидазой

136

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

ГХ ИУК ГХ ОДН ОДНИУК

Неконку- Конкурентный рентный

тип тип

ингиби-Т Т т ингиби- т

Р°вания Продукты окисления АК рования

Рис. 5°.Влияние ИУК на реакции пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина.

зависело от рН среды и природы субстрата. Субстраты, имеющие близкую с ИУК полярность, значительно повышали эффективность связывания ингибитора с пероксидазой. Поэтому преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы, по-видимому, должна быть гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков. Подтверждением различных мест связывания о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному пероксидазному окислению этих субстратов.

Использование ИУК в качестве ингибитора реакций пероксидазного окисления АК позволило определить место локализации участка связывания молекул аскорбиновой кислоты в активном центре пероксидазы. По-видимому, таким участком является ди-стальная область активного центра пероксидазы. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления АК, когда в активном центре фермента связывается по крайней мере одна молекула субстрата. При связывании двух и более молекул АК с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК, что, возможно, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата. Использование ИУК позволяет высказать предположение, что участки связывания молекул АК пространственно удалены; проявлением этого является неконкурентный характер ингибирования пероксидазы ИУК при окислении АК в присутствии второй молекулы субстрата. При этом связывание ИУК в активном центре пероксидазы создает препятствие

137

Глава III

для протекания реакции пероксидазного окисления АК. Однако ингибитор проявляет неконкурентный характер ингибирования при окислении двух и более молекул АК (рис. 60).

Сложность механизмов пероксидазного окисления органических субстратов, таких как о-дианизидин, гидрохинон, аскорбиновая кислота, фенотиазины и другие, позволяет предположить, что область активного центра пероксидазы разделена на несколько участков, где могут упорядоченно связываться окисляемые субстраты, и регуляторный участок, связывание в котором субстратов может регулировать протекание каталитического процесса. Последовательное связывание в этих участках субстратов создает условия для управления ферментативным процессом, основанного на принципе корпоративного взаимодействия субстратов.

Наличие регуляторного участка на поверхности белковой глобулы фермента выявлено в исследованиях реакций совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия (рис. 61), а также аскорбиновой кислоты и гидрохинона (рис. 62). Проведенное картирование активного центра пероксидазы на основании кинетических данных индивидуального и совместного окисления субстратов позволило выделить два разных участка в активном центре пероксидазы, связывание в которых субстратов обусловлено природой и индивидуальностью их строения. Осо-

AKj АК,

00

Пероксидаза с двумя участками связывания субстратов

AKi ИУК

Неконкурентное ингибирование

Продукты окисления АК

Рис. 60. Участие индолил-3-уксусной кислоты в реакциях пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты.

138

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Пероксидаза с двумя участками связывания

субстратов ФК

АК, AKj ФК АК,

Пероксидаза с двумя участками связывания

субстратов и регуляторным участком

Смешанная активация

Р^,

Продукты окисления АК Рис. 61. Схема механизма совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия.

бенно это проявляется в реакциях совместного окисления субстратов при осуществлении которых утрачивается неизбирательность в действии фермента и приобретается специфичность выбора окисляемого субстрата, а также устанавливается упорядоченное окисление субстратов. Т.е. каждый из участвующих в реакции субстра-

Пероксидаза с двумя участками связывания

субстратов ГХ

АК, АК; ГХ АК,

ГХ

Пероксидаза с двумя участками связывания

субстратов и регуляторным участком

Неконкурентный тип активации

РэКа.

Продукты окисления АК Рис. 62. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона.

139

Глава III

тов приобретает сродство к индивидуальному участку связывания в активном центре фермента, которое условно можно обозначить согласно природе связывающихся субстратов. Один участок связывания о-дианизидина, а другой — гидрохинона (рис. 59). В о-ди-анизидиновом участке кроме о-дианизидина среди исследуемых нами субстратов могут связываться: хлорпромазин, ИУК, триптофан, строфантин G, аскорбиновая кислота, НАДН, амид III, салицилат натрия, а в гидрохиноновом участке — ферроцианид калия, трифтазин, тиопроперазин, дигоксин. Причем субстраты, связывающиеся в одном участке, мог