Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

субстратам пероксидазы, ингибирующий эффект которых в реакции окисления о-дианизидина достигается за счет их прочного связывания в активном центре фермента. Некоторые вещества, реагируя с пероксидазой, инактивируют фермент. Так, необратимое инактивирующее действие фенилгидразина связано с модификацией функциональных групп пероксидазы (предположительно остатка триптофана) свободнорадикальны-ми продуктами его некаталитического и каталитического окис-

125

Глава III

ления, образующимися при инкубировании с пероксидазой [Лебедева, 1980]. Это приводило к изменению конформацни активного центра фермента, частичному экспонированию гема в раствор и последующей его деструкции. Тиомочевина является не только конкурентным обратимым ингибитором пероксидазного окисления о-дианизидина, но способна модифицировать фермент, что приводит к его инактивации. Для однозначной интерпретации результатов, полученных при изучении влияния амида III на каталитические свойства пероксидазы, прежде всего было выяснено, не связано ли изменение каталитической активности фермента с побочными действиями ингибитора: 1) инактивацией и модификацией пероксидазы амидом III; 2) реакцией ингибитора с субстратами пероксидазы — перекисью водорода и о-дианизидином — в ходе каталитического процесса. Добавление амида III снижало активность фермента, однако последующее инкубирование фермента в присутствии ингибитора не приводило к дальнейшему изменению активности пероксидазы. Присутствие в среде субстрата пероксидазы — о-дианизидина несколько уменьшало влияние амида III на активность фермента. Специальными экспериментами было показано, что исследуемый амид III не реагирует ни с перекисью водорода, ни с о-дианизидином (исследовались спектр поглощения амида III в присутствии Н202 и изменение концентрации Н202 при ее инкубировании с амидом III при концентрациях амида III 0,05 М и Н202 8 мМ). Активность пероксидазы определяли по о-дианизидину, используя Н202 в концентрации в 4 раза меньшей насыщающей. Установлено, что ни спектр амида III, ни концентрация Н202 в инкубируемой смеси не изменялись в течении часа. Кроме того, при инкубировании о-дианизидина в присутствии 0,16 мМ Н202 и 10 мМ амида III, не происходило окисление о-дианизидина в отсутствие пероксидазы, т.е. не наблюдалось увеличения скорости фоновой реакции, которая составляла в данном случае менее 3%. Следовательно, изменение активности пероксидазы в присутствии амида III можно объяснить его ингибирующим влиянием на фермент, но не инактивацией фермента. Обратимость ингибирую-щего действия амида III на пероксидазу проводили методом разбавления. При разбавлении смеси пероксидаза — амид III в 10 раз при рН 5,0, активность фермента понижалась в 8 раз, а при рН 7,5 — только в 5 раз. Следовательно, процесс взаимодействия пероксидазы с амидом III обратим и зависит от рН.

126

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Кинетика пероксидазного окисления о-дианизидина нативной и модифицированной СМЕ-карбодиимидом пероксидазы как в присутствии, так в отсутствие амида III подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен (рис. 53). Точка пересечения пучка прямых лежит в правом верхнем квадранте, что свидетельствует о сложном механизме влияния амида на нативную пе-роксидазу. Действительно, с ростом концентрации амида увеличивается как V , так и К фермента, однако отношение степеней их изменения меньше 1, поэтому можно рассматривать амид как ингибитор нативной пероксидазы.

Из экспериментальных данных, представленных как зависимость кинетических констант от концентрации амида в координатах

1 _ 1 аК, J_

v^>/vm-rp-i+p-ix[i]

1 1 aKj J_

К^/К^-Га-lVui]

определяли величины а и Р (рис. 54). Зависимости ингибирования пероксидазного окисления о-дианизидина под действием амида были аналогичны в диапазоне рН 5,0-7,5. При увеличении рН от 5 до 7,5 величина ос возрастает в 4 раза, а В — в 1,5 раза (табл. 15). Константу инги-

Рис. 53. Зависимость начальной скорости окисления нативной пероксидазой о-дианизидина от его концентрации в присутствии амида III. Концентрации: пероксидаза — 0,04 нМ; о-дианизидин — 0,012—0,18 мМ; перекись водорода — 0,64 мМ; амид III - 1-0; 2-10; 3-20; 4-40; 5-60 мкМ; 0,01 М натрий-фосфат, 0,1 М KN03, рН 6,0.

0-1-¦-.-.-,-.-.-¦-.-.-1-0

2 4 6 8 10

1/амидШ 10~\ М"1 Рис. 54. Определение постоянных a (1) и р (2) для процесса ингибирования пероксидазы в присутствии амида 111 при окислении о-дианизидина. Условия те же, что на рис. 53.

127

Глава III

Таблица 15

Константы Михаэлиса и константы а и В для ингибирования амидом III реакции окисления о-дианизидина, катализируемой нативной и модифицированной карбодиимидом пероксидазой при различных рН

Пероксидаза рН нативная модифициро- нативная модифициро-

ванная ванная

к., К,,мкМ к, К., о Р о р

мкМ мкМ мкМ

5,0 33 + 3 250+ 15 50 + 5 79 + 6 4,3+0,2 1,6 + 0,2 20 + 2 6 + 1

5,5 32 + 3 130+ 12 н.о. н.о. 7,6 + 0,2 1,2±0,1 н.о. н.о.

6,0 42±4 94±5 35 + 2 42±3 7,7 + 0,2 2,4 + 0,2 н.о. н.о.

7,0 26 + 2 62 + 5 н.о. н.о. 8,1+0,2 1,8 ±0,2 н.о. н.о.

7,5 15 + 2 34 + 2 19 + 2 24 + 2 17,7 + 0,4 2,2 + 0,2 н.о. н.о.

н.о. — не определяли.

бирования (К.) рассчитывали методом Диксона [Березин, Кле-сов, 1976].

При рН 5,0 амид III ингибировал пероксидазу, модифицированную СМЕ-карбодиимидом, по тому же механизму, что и на-тивный фермент (точка пересечения в правом верхнем квадранте). При рН > 5,5 наблюдался конкурентный тип ингибирования

модифицированной пероксидазы (рис. 55).

Изучение рН-зависимости константы ингибирования амидом III нативной пероксидазы показало, что на величину К. влияет ионизация группы с рК 6,0, депротонирование которой улучшает связывание амида III с пероксидазой (рис. 56), причем в диапазоне рН 5,0—7,5 константа ингибирования изменяется почти в 10 раз (табл. 15).

Для пероксидазы модифицированной СМЕ-карбодиимидом в том же диапазоне рН К. изменяется в 3 раза и при этом не проявляется влияние группы с рК 6,0 (рис. 56).

1/о-дианизидин 10 , М Рис. 55. Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина пероксидазой, модифицированной СМЕ-карбодиимидом, от его концентрации в присутствии амида III. Концентрации: модифицированная пероксидаза— 0,2 нМ; о-дианизидин — 12— 180 мкМ; перекись водорода — 0,64 мМ; амид III - 1-0; 2-10; 3-20; 4-40; 5-800 мкМ; 0,1 М натрий-фосфат, 0,1 М KN03, рН 6,0.

128

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Необычный тип ингибирования амидом III нативной пероксидазы показывает, что ингибитор влияет как на связывание субстрата, так и на процесс его превращения.

Ингибирование нативной пероксидазы амидом III можно описать схемой 11 [Лебедева и ДР., 1977].

Пероксидаза, модифицированная СМЕ-карбодиимидом, образуете амидом III фермент-ин-гибиторный комплекс [мЕ, — I], не способный связывать окисляемый субстрат (кон

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.05.2019)