трофенилпропилендиамин (DPP-диамин), моно-динитрофенил-додекандиамин (DPD-диа-мин), а также пропилендиамин (Pr-диамин), гексаметилендиамин (СМ-диамин) и гидроксиламин.

Спектры свободного и связанного с ферментом PDP-карбо-диимида различаются (рис. 43), это свидетельствует об образовании химического соединения карбодиимида с белком. Через 1,5 ч инкубации с PDP-карбодиимидом в отсутствие аминов активность пероксидазы падает до 65%, при действии EDP-карбодиимида — до 40% и в присутствии СМЕ-карбодиими-да — до 30%. Удлинение инкубации не изменяет активности фермента, хотя общее число модифицированных групп может возрастать. Таким образом, за 1,5 ч в реакцию вступают все СООН-группы, влияющие на каталитическую активность пероксидазы. Аналогичные результаты были получены при увеличении избытка PDP-карбодиимида. В этих опытах было показано, что падение активности обусловлено реакцией с

104

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

е - 10~4, М-1 см-1

е - Ю-4, NT1 см-1

10-

6-

4 -

Рис. 43. Спектр поглощения пероксидазы нативной (1), модифицированной PDP-карбодиимидом (2) и PDP-карбодиимида (4): 3 — разностный спектр нативной и модифицированной пероксидазы (рН 6,0, 22 °С, 0,05 М NaCl).

карбодиимидом единственной функциональной группы фермента (рис. 44).

Полученные данные показывают, что падение активности пероксидазы обусловлено исключительно модификацией ее карбоксильных групп.

1. Поскольку спектры модифицированной и нативной пероксидазы тождественны, можно исключить денатурацию фермента.

2. Обработка модифицированной пероксидазы 1 М раствором гидроксиламина (рН 7,5; 22 °С, 22 ч), обычно используемая для регенерации модифицированных ОН-групп тирозина [Jouselle, 1977], не приводит к восстановлению активности фермента. Сле-

105

Глава III

-i-г

30 40 50 моль/моль белка

70

12 3 4

моль/моль белка

Рис. 44. Модификация пероксидазы PDР-карбодиимидом (1,5 ч): а — зависимость числа присоединенных остатков (п) от избытка реагента; б— зависимость относительной активности пероксидазы, от числа присоединенных остатков (условия определения активности на рис. 43).

довательно, падение активности пероксидазы не связано с модификацией поверхностных ОН-групп тирозина.

3. Падение активности не связано с модификацией е-амино-групп лизиновых остатков, так как ранее было показано, что модификация всех шести аминогрупп не влияет на каталитическую активность пероксидазы [Угарова и др., 1978а; 19786]. Действительно, падение активности пероксидазы при обработке карбо-диимидами не зависит от предварительного ацетилирования всех доступных аминогрупп. Этот результат одновременно показывает, что падение активности не связано с возможным образованием внутримолекулярных сшивок.

4. При действии на пероксидазу СМЕ- и EDP-карбодиими-дов образуется 15—20% димеров, которые отделяли от мономеров фермента гель-хроматографией на сефадексе G-100. Актив-

106

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

ность димеров была такая же, как у мономеров, следовательно, падение активности при модификации пероксидазы не связано с образованием межмолекулярных сшивок.

Можно ожидать, что в препаратах пероксидазы, обработанных карбодиимидами в отсутствие нуклеофильных агентов, модифицированные карбоксильные группы превращены в ацилмо-чевинные, при этом общий положительный заряд молекулы фермента должен увеличиться. Это подтверждалось уменьшением подвижности пероксидазы, модифицированной СМЕ- и EDP-карбодиимидами, при ее хроматографии на СМ-целлюлозе (рис. 45). Активность препаратов после хроматографии не изменялась, это указывает на устойчивость производных фермента, по-видимому обусловленную перегруппировкой лабильных О-ацилмочевин в N-ацилмочевины. Согласно предположению Тимковича [Timkovich, 1977], подобная перегруппировка, а не гидролиз, характерна для тех карбоксильных групп, которые мало доступны молекулам воды после образования О-ацилмочевины, т.е. для групп, частично маскированных в глобуле.

Напротив, при хроматографии на СМ-целлюлозе пероксидазы, модифицированной PDP-карбодиимидом, элюируемый белок не содержал остатков карбодиимида и подвижность его была точно такая же, как у нативного фермента. Продукт же превращения карбодиимида элюировался с колонки только растворами высокой ионной силы и имел максимум поглощения при 335 нм (как и остатки карбодиимида в модифицированной пероксидазе). Активность пероксидазы в элюате полностью восстанавливалась, что свидетельствует о регенерации карбоксильных групп фермента.

По-видимому, О-ацилмоче-винные группы, образующиеся при взаимодействии пероксидазы с PDP-карбодиимидом, не перегруппировываются в N-ацилмо-чевинные и подвергаются гидро-

10 20 30 40 50 60 V, мл

Рис. 45. Хроматография на СМ-целлюлозе пероксидазы нативной (1), модифицированной EDP-карбодии-мидом (2), и EDP-карбодиимидом в присутствии Рг-диамина (3), GM-ди-амина (4). Пунктиром показан градиент буферного раствора.

107

Глава III

лизу в присутствии СМ-целлюлозы. В этой связи можно отметить, что остатки PDP-карбодиимида, связанные с пероксидазой, по положению максимума полосы поглощения (335 нм) отличаются как от соответствующих модельных N-ацилмочевины, так и от пепсина, модифицированного этим карбодиимидом (325 нм [Баландина и др., 1975]).

Присутствие в среде аминов, содержащих динитрофенильную группу [Матяш и др., 1972], не сказывается на степени инактивации пероксидазы при ее обработке 0,1 М раствором EDP-карбо-диимида. Связывание DPD-диамина с пероксидазой наблюдается лишь при его значительном избытке (300 моль/моль белка). После отделения реагентов гель-фильтрацией на сефадексе G-25 модифицированный препарат по спектрофотометрическим данным содержит около 1,3 динитрофенильных остатков на молекулу белка, из которых примерно половина может быть отделена последующей хроматографией на СМ-целлюлозе или же повторной гель-фильтрацией после 3-часовой инкубации в 1 М ацетатном буфере (рН 5). Таким образом, есть основания полагать, что EDP-карбо-диимид наряду с ковалентным связыванием DPD-диамина вызывает и его сорбцию белком. Аналогичные результаты получены при использовании DPP-диамина и особенно DPD-диамина (табл. 11). Эффект сорбции, по-видимому, обусловлен разрыхлением белко-

Таблица 11

Взаимодействие пероксидазы (0,025 мМ) с EDP-карбодиимидом (0,1 М) и нуклеофильными реагентами, рН 5,0, 22 °С, 1,5 ч

Реагенты Концентрация, моль/ моль белка Связывание реагента, моль/моль белка Активность, % от исходной

после гельфильтрации после хроматографии на СМ-целлюлозе Контроль - - 40

DPG-диамин 50 0 0 40

DPG-диамин 300 1,3 0,6 35

DPG-диамин 300 1,6 1,0 35

DPG-диамин 300 2,9 0,7 37

Рг-диамин 340 3,0 3,0 30

GM-диамин 340 2,5 2,5 40

NH2OH 40000 7,0 7,0 30

108

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

вой глобулы под влиянием высокой концентрации карбодиимида и низ