Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

членное, реже

Величины каталитических констант пероксидазного окисления

Субстраты

РН тиопроперазин хлорпромазин

мкМ с' К мкМ а Р тип активации мкМ К. с 1 К, мкМ а Р тип ингибирования

5,0 90 9,8 30 5,7 5,7 б/к 130 42 94 0,53 0,55 си.

5,5 ПО 4,3 18 6,6 6,6 б/к 77 24 79 0,74 0,71 си.

6,0 196 2,9 30 1,4 1,4 б/к 44 15 26 2,04 0,08 си.

7,0 40 0,35 84 0,30 1,3 са. 177 7,4 30 К.И.

7,5 22 0,12 125 0,55 2,9 са. 200 3,2 25 к. и

Примечание. В таблице приняты следующие сокращения: б/к — бесконкурент-вания, к.и. — конкурентный тип ингибирования, н/к — неконкурентный тип

90

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

шестичленное лактонное кольцо. Стероидные гликозиды способны при взаимодействии с клеточными мембранами увеличивать их проницаемость [Богатский и др., 1960]. Они обладают высокой реактивностью за счет подвижности атома водорода аглико-на, который может образовать стабильный промежуточный радикал ингибитора [Кинтя и др., 1982], выполняя таким образом роль антиоксиданта в клетках.

Однако участие строфантина G в реакциях пероксидазного окисления медленно и быстро окисляемых субстратов пероксидазы не изучено. Поэтому мы изучили влияние строфантина G на пероксидазное окисление медленно (хлорпромазин, тиопроперазин, трифтазин) и быстро (о-дианизидин) окисляемых субстратов пероксидазы хрена в широком диапазоне рН, предложив возможные механизмы активирования и ингибирования строфантином G пероксидазы в реакциях пероксидазного окисления медленно окисляемых субстратов (табл. 10).

Показано, что строфантин G может связываться в активном центре фермента, влияя на процесс пероксидазного окисления медленно и быстро окисляемых субстратов пероксидазы [Рогожин, Рогожина, 2000]. Причем проявлялась двойственность его действия в реакциях пероксидазного окисления медленно окисляемых субстратов пероксидазы. Например, в реакциях окисления тиопроперазина строфантин G активировал окисление. При

Таблица 10

субстратов пероксидазы в отсутствие и в присутствии строфантина G

пероксидазы

трифтазин о-дианизидин К. мкМ К. с' мкМ а Р тип ИНГИ биро-вания мкМ К. с' АГ, мкМ тип ингибирования

330 124 710 н/к 40 2500 178 а/к

150 38 715 н/к 35 3000 128 а/к

57 7,4 720 н/к 30 2200 108 а/к

21 0,7 510 1,5 0,75 си. 18 600 115 а/к

9,5 0,3 320 4,4 0,26 си. 20 150 98 а/к

ная активация, са. — смешанная активация, си. — смешанный тип ингибиро-ингибирования, а/к — антиконкурентный тип ингибирования.

91

Глава III

1/ГП • КГ4, NT1 1ЯПЮ-4,М-'

Рис. 34. Зависимости обратных начальных скоростей окисления тиопроперазина при различных концентрациях строфатина G: 0 (1), 8,6 (2), 17,2 (3), 25,8 мкМ (4); концентрация Н202 0,64 мМ; а — 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,19 нМ пероксидаза; б— 0,1 М трис-HCl буфер, рН 7, 280 нМ пероксидаза.

этом тип активирования зависел от рН, проявляясь при рН 5,0— 6,0 в бесконкурентном характере (рис. 34, а), тогда как возрастание рН приводило к смене типа активирования с бесконкурентного типа на смешанный (рис. 34, б), что, возможно, связано с участием в этом процессе одной из функциональных групп активного центра фермента или белка с рК~ 6,0. При рН 5,0—6,0 отмечалось наиболее эффективное связывание строфантина G в активном центре пероксидазы, что приводило к ускорению пероксидазного окисления тиопроперазина, проявляемое в бесконкурентной активации. При рН > 6,0 связывание активатора ухудшалось, однако его присутствие в активном центре улучшало последующее связывание тиопроперазина повышая эффективность каталитического превращения (табл. 10). Несколько иное действие проявлял строфантин G в реакциях пероксидазного окисления хлорпромазина, трифтазина и о-дианизидина.

Строфантин G ингибировал пероксидазное окисление хлорпромазина при рН 5,0—6,0, влияя как на связывание субстрата, так и на его превращение. Тогда как депротонирование функциональной группы активного центра фермента с рК~6,0 приводило к изменению характера ингибирования со смешанного типа на конкурентный (рис. 35, о, б). При этом можно отметить, что связывание строфантина G в активном центре пероксидазы замедляло реакции пероксидазного окисления хлорпромазина, а депротонирование одной из функциональных групп активного центра фермента приводило к тому, что связывание ингибитора затрудняло последующее связывание субстрата.

92

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

а 20- 1/V Ю-4, мин М 1 4 JjS 3

16- ^Ху- 2

12 ¦

8 •

4-

-2 ¦ 1 ¦ 1 2 4 6 8

1/АМ ю-4, М"1

20 16 12 8Н

1/v- ЮЛ минМ_,Х4 3 2 1

1/АМ - ЮЛ М"1

Рис. 35. Зависимости обратных начальных скоростей пероксидазного окисления аминазина при различных концентрациях строфатина G: 0 (1), 8,6 (2), 17,2 (3), 25,8 мкМ (4); концентрация Н202 0,64 мМ; а — 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5, 24 нМ пероксидаза; 6—0,1 М Tris-HCl буфер, рН 7, 47 нМ пероксидаза.

Таким образом, строфантин G и хлорпромазин при рН > 6,0 могут конкурировать за место связывания в активном центре фермента, при этом связывание ингибитора препятствует последующему связыванию субстрата, что и приводит к понижению скорости ферментативной реакции. Несколько иной тип ингибирования проявлял строфантин G в реакциях пероксидазного окисления трифтазина. При кислых значениях рН строфантин G связывался вблизи активного центра фермента, не влияя на связывание субстрата, что проявлялось в неконкурентном характере ингибирования (рис. 36, а). Депротонирование одной из функциональных групп активного центра пероксидазы с рК ~ 6,0 резко ухудшало каталитическое превращение трифтазина, пони-

1/v, мин мкМ ~,4

0,6 -

0,4- о^<- 1

0,2-

2 0 2 6 10

1/ТФ- ю-4, М"1

1/v, мин мкМ 1

1/ТФ

Рис. 36. Зависимости обратных начальных скоростей окисления трифтазина при различных концентрациях строфатина G: 0 (1), 8,6 (2), 17,2 (3), 25,8 мкМ (4); концентрация Н202 0,64 мМ; а — 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН6, 40 нМ пероксидаза; б— 0,1 М трис-HCl буфер, рН 7, 95 нМ пероксидаза.

93

Глава III

1/v 1(Г4, мин М-1

4 жая kcat в 10—23 раза. Хотя при 2 этом Кт улучшалось в 2,7— i 6,0 раз. По-видимому, заряд этой

22-

18-

ионогенной группы может оказывать влияние на расположение строфантина G в активном центре фермента, что приводит к смене характера ингибирования с неконкурентного на смешанный (рис. 36, б). Показано, что строфантин G ингибирует пероксидазу в реакциях окисле-

14-

10

. ... —¦ -, -т — , ...,„,, , ,

0 4 8 12

1/о-дианизидин 10 , М

Рис. 37. Зависимости обратных начальных скоростей окисления о-дианизидина в присутствии различных

концентраций строфантина G: 0 (1), НИЯ О

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)