Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

к ферроцианиду (рис. 30). При совместном присут-

l/v Ю-4, мин М"1

-20-15 -10 -5

l/[K4Fe(CN)6], мМ~

Рис. 29. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления ферроцианида калия в присутствии аминазина, мкМ: 1-0; 2-56; 3-84; 4-112; пероксидаза — 40 нМ; перекись водорода— 0,64 мМ; 0,1 М Na-фосфатный буфер рН 6,5.

2-

Igl^ + 6, lg а + 1

4 2

-1-1111

4,5

5,5

6,5

рН

7,5

Рис. 30. рН-Зависимости lg Ка (1) и lg а (2) для реакции пероксидазного окисления ферроцианида калия в присутствии аминазина. Кривые являются те-

оретическими для рК

'а(ФР + AM)

5,75,

К„ = 198 мкМ; рК, = 6,19, о,.

a(hm) * г а(а) * 1 |„

= 0,828.

86

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

ствии хлорпромазина и ферроцианида калия скорость пероксидазного окисления последнего возрастала за счет того, что хлорпромазин связывался в активном центре пероксидазы вблизи места связывания молекулы ферроцианида, стабилизируя промежуточный комплекс фермента с ферроцианидом.

На рис. 31 показаны спектры трифтазина и тиопроперазина в 0,1 М натрий-ацетатном буфере при рН 4,5 [Рогожина, Рогожин,

А

т-1-1-1

400 300 200

Длина волны, нм

Рис. 31. Спектры поглощения трифтазина (а), тиопроперазина (б) и продуктов их пероксидазного окисления в 0,1 М натрий-ацетатном буфере, рН 4,5. Время реакции, мин: 1-0, 2-1,5, 3-3,5, 4-6,5, 5-19,5 (трифтазин); 1-0, 2-2,0, 3-5,5, 4-10,5, 5-37,0 (тиопроперазин). Концетрации: трифтазин — 17,4 мкМ; тиопроперазин —19,0 мкМ; пероксидаза — 30,0 нМ; перекись водорода — 0,64 мМ.

87

Глава Ш

2002]. Видно, что в спектрах производных фенотиазина проявляются три выраженных максимума поглощения в УФ-области (ТФ— 215, 257, 310 нм; ТП - 235, 265, 310 нм). В процессе пероксидазного окисления в спектре поглощения трифтазина появляются три максимума поглощения при 232, 303, 350 нм, а ти-опроперазина — 243, 305, 355 нм. В течение первых минут проведения реакции спектры трифтазина и тиопроперазина изменялись — максимумы поглощения при 257 и 265 нм полностью исчезали. Поэтому определение скорости пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина в присутствии пероксидазы хрена проводили, регистрируя уменьшение поглощения свето-поглощения для трифтазина при 257 нм, а тиопроперазина — при 265 нм. В отсутствие фермента реакции не наблюдались.

Реакции индивидуального пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина характеризовались низкими значениями каталитических констант 0,3—124 и 0,12—9,8 с-1 соответственно, что позволяет отнести их к группе медленно окисляемых субстратов пероксидазы. Величины Кт для трифтазина и тиопроперазина мало различаются и составляют соответственно 10—330 и 22-196 мкМ в зависимости от рН. Значения Кт трифтазина и тиопроперазина при рН > 6,0 примерно такие же, как у о-дианизидина.

На кривых рН-зависимостей lgk^ и lgkca/Km реакций пероксидазного окисления трифтазина (рис. 32) и тиопроперазина (рис. 33), определялись ионогенные группы с рК 4,9, 5,6 и 5,4, 4,7 соответственно, депротонирование которых ухудшает каталитический процесс пероксидазного окисления соответственно трифтазина в 413 раз, а тиопроперазина в 82 раза.

При значениях рН > 6,0 имело место отклонение опытных кривых рН-зависимостей для lgkcat/Km от теоретической для реакций пероксидазного окисления трифтазина и тиопроперазина, что, возможно, вызвано проявлением действия еще одной ионогенной группы свободного фермента, принимающей участие в связывании субстрата.

В отличие от хлорпромазина, у трифтазина и тиопроперазина, с увеличением рН значения Кт понижались. В кислых рН (4,5— 5,5) трифтазин окислялся быстрее хлорпромазина в 1,5—3 раза и в 9—12 раз эффективнее тиопроперазина. Константа Михаэлиса трифтазина в 2—2,5 раза больше, чем у хлорпромазина и в 1,5— 3,5 раза — тиопроперазина. Однако при рН > 6,0 величины Кт трифтазина и тиопроперазина понижались и становились соиз-

88

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Рис. 32. рН-Зависимости lg кса1 (1), lg Km (2) и lg kcai/Km (3) для реакций пероксидазного окисления трифтазина. Пунктирные кривые рассчитаны с использованием значений рК = 4,89, к ,. = = 129 с-1; рКа = 5,64, (kcat/Km),im = 5'Г,8 ¦ ¦ Ю4 с-1 М-'.

Рис. 33. рН-Зависимости lg Km (1), lg k.ai/ Km (2) и lg kcal (3) для реакций пероксидазного окисления тиопроперазина. Пунктирные кривые являются теоретическими для рК = 5,43, kcat(|im) = = 12,9c-';pKa = 4,71,(ka,/Km)lim = 30,5-¦ lf/c-'M-1.

меримы с Km для быстро окисляемого субстрата пероксидазы — о-дианизидина.

Низкие значения константы скорости окисления фенотиази-нов, возможно, как в случае с НАДН и аскорбиновой кислотой в первую очередь обусловлены тем, что их окисление пероксидом водорода протекает по одноэлектронному механизму аналогично окислению неорганических субстратов пероксидазы. Поэтому при совместном окислении о-дианизидина и различных фенотиазинов фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата выбор которых определяется доступностью функциональных групп субстрата каналам переноса электронов на поверхности белковой глобулы [Лебедева, Угарова, 1996]. Среди изученных фенотиазинов расположение функциональных групп хлорпромазина обеспечивает его преимущественное пероксидазное окисление по сравнению с о-диани-зидином. При этом вначале полностью окислялся хлорпромазин, а затем наблюдалось окисление о-дианизидина.

При рН 4,0—5,5 тиопроперазин и о-дианизидин могли связываться в активном центре пероксидазы. Причем связывание тиопроперазина улучшало последующее связывание о-дианизидина, но замедляло скорость его пероксидазного окисления, что проявляется в антиконкурентном типе ингибирования. Т.е. тиопроперазин способен связываться только с фермент-субстратным комп-

89

Глава III

лексом и не связывается со свободным ферментом. С возрастанием рН (рН > 5,5) происходило депротонирование одной из функциональных групп активного центра фермента и это способствовало переключению механизма переноса электронов с донора водорода о-дианизидина на преимущественное окисление донора электронов — тиопроперазин. Противоположный эффект наблюдался при совместном окислении о-дианизидина и трифтазина. Последний возможно и связывался в активном центре фермента, однако его окисление не происходило, поскольку реализовывался механизм окисления донора водорода — о-дианизидина.

3.7.2. ВЛИЯНИЕ СТРОФАНТИНА G НА КИНЕТИКУ ПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ ФЕНОТИАЗИНОВ

Ряд соединений, относящихся к стероидным гликозидам (ци-гоксин, строфантин и др.), не являются субстратами пероксидазы, так как не способны реагировать с промежуточными окисленными формами фермента (Е, и Е2). Однако эти соединения обладают антиоксидантным действием. Стероидные гликозиды в химическом отношении родственны между собой и являются сложными органическими соединениями в составе которых углеводы (гликоны) и агликоны (генины) в основе имеют пергид-рофенантренциклопентан к семнадцатому углеродному атому которого присоединяется ненасыщенное пяти

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.08.2019)