|
|
Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмовруемых пероксидазой. Реализация действия ауксина возможно проявляется при выходе семян из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность пероксидазы, которая способна активировать процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных радикалов, необходимых на конечных этапах эмбриогенеза для активизации механизмов прорастания. 3.6. ВЛИЯНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АОТИОКСИДАНТОВ (АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА, КВЕРЦЕТИН, ДИГОКСИН) НА РЕАКЦИИ ПЕРОКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ О-ДИАНИЗИДИНА К антиоксидантам относятся вещества, способные подавлять образование свободных радикалов в живых организмах. Антиок-сиданты можно разделить на низко- и высокомолекулярные соединения [Кения и др., 1993]. К группе низкомолекулярных ан-токсидантов относятся мочевина, мочевая кислота, глутатион, аскорбиновая кислота, кверцетин, дигоксин и др. [Кения и др., 1993; Дубинина, Шугалей, 1993; Владимиров, Арчаков, 1972]. Кг-руппе высокомолекулярных: каталаза, СОД, пероксидаза. Функциональная роль аскорбиновой кислоты в метаболических процессах связана с образованием промежуточных продуктов ион-радикалов семихинонного типа при ее окислении [Руг- 78 Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов ге, Блюменфельд, 1965]. Высказано предположение, что способность АК отдавать электроны соответствующим акцепторам и образовывать ион-радикалы лежит в основе участия аскорбиновой кислоты в окислительно-восстановительных процессах, причем АК может участвовать в транспорте электронов и окислении пиридиновых коферментов [Ругге, Блюменфельд, 1965]. Известно, что окисление аскорбиновой кислоты в дегидроас-корбиновую кислоту кроме специализированной аскорбатокси-дазы [Paciolla et al. 1991] могут катализировать и другие оксидазы: цитохромоксидаза, фенолоксидаза, пероксидаза [Матусис, 1974]. Однако окисление аскорбиновой кислоты пероксидазой мало изучено в связи с тем, что АК является медленно окисляемым субстратом фермента и данная реакция не имеет практического значения. Хотя известно, что при одновременном присутствии в растворе различных субстратов пероксидазы (медленно и быстро окисляемых) наблюдаются эффекты взаимной активации и ингибирования. При этом ингибирование либо имеет конкурентный характер, либо связано с дифференцированным окислением субстратов в присутствии пероксидазы [Лебедева, Угарова, 1996]. Пероксидаза совместно с низкомолекулярными антиоксидан-тами (токоферолы, строфантин, дигоксин, кверцетин, аскорбиновая кислота и др.) входит в состав антиоксидантной системы живых организмов, регулирующих действие активных форм кислорода. Поэтому нами были изучены реакции совместного пероксидазного окисления некоторых антиоксидантов (дигоксин, кверцетин и аскорбиновая кислота) с о-дианизидином [Рогожин, Верхотуров, 1998в]. Показано, что антиоксиданты могут ингибировать перокси-дазное окисление быстро окисляемого субстрата, катализируемое пероксидазой хрена. Дигоксин, связываясь с фермент-субстратным комплексом в котором присутствует стабильный полуокисленный продукт о-дианизидина, ингибировал пероксидазу по антиконкурентному типу в реакциях индивидуального и совместного с ферроцианидом окисления о-дианизидина при всех изученных значениях рН (рис. 24). Проявляя антиоксидантные свойства, дигоксин подавлял реакции свободнорадикального окисления о-дианизидина. Причем сродство ингибитора к ферментсубстратному комплексу в реакциях совместного окисления было в 5—6 раз выше, чем в реакциях индивидуального окисления о-дианизидина и зависело от рН (табл. 9). 79 Глава 111 Таблица 9 Значения константМихаэлиса и ингибирования пероксидазного окисления субстратов пероксидазы хрена рН мкМ Кп (АК) > мкМ Кп(ОДН+АК>' мкМ ^нодн+дп» мкМ ^Чодн+лг+ +ФК)мкМ ^1<ОДН+КВ>> мкМ а Р 5,0 40 ± 340 ± 37 ± — — 2,5 ± 5,6 ± 0,24 ± ±4 + 30 ±4 ±0,2 ±0,4 ±0,02 5,5 35 ± 170 + 27 ± 298 ± 150 + 2,7 ± 4,4 ± 0,22 ± ±3 ±15 ±3 ±12 ±6 ±0,2 ±0,3 ±0,02 6,0 30 ± 190 ± 25 ± 244 ± 120 ± 2,9 ± 2,3 ± 0,24 ± ±2 ± 10 ±2 ±8 ±5 ±0,2 ±0,2 ±0,02 6,5 20 ± 150 + 27 ± 193 ± 95 ± — — — ±2 ±15 ±3 ±5 ±4 7,5 15 + 120 ± 18± 177 + 65 ± — — — ± ! ± 10 ±2 ±4 ±2 Для объяснения кинетики ингибирования пероксидазы ди-гоксином в реакции индивидуального и совместного окисления о-дианизидина и ферроцианида может быть предложена схема 6. схема 6 Е+НА—Ь"-»Е, [Е2-Р'-1] Ki, it [I] Е, + S, г5-» Е, - S, —Е2 - Р'—Ь-> Е+Р, k5i[S2] [E.-S.1+P, [I]UKi2 [I-E.-SA I — дигоксин, E2 —P- — I, I —E, — S, — комплексы дигоксина с полуокисленным о-дианизидином. Тогда как кверцетин ингибировал пероксидазу по смешанному типу (рис. 25). При связывании с ферментом кверцетин понижал сродство и эффективность превращения о-дианизидина. Смешанный тип ингибирования вызван конкуренцией двух субстратов пероксидазы один из которых является медленно окис- 80 Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро-окисляемых субстратов 1/v Ю-5, мин М-1 I/v Ю-3, мин М О 2 4 6 8, Ю ,12 о-дианизидин , мМ Рис. 24. Зависимость начальной скорости окисления о-дианизидина от его концентрации при различных концентрациях дигоксина, мкМ: 1-0, 2-27,5, 3-41,0, 4-69,0. Концентрации: пероксидаза — 0,13 нМ; перекись водорода — 0,64 мМ; рН 5,0, 0,1 М натрий-ацетат. -I—I—I—I—г-2 7 12 1/о-дианизидин, мМ Рис. 25. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина от его концентрации при различных концентрациях кверцетина, мкМ: 1-0, 2-24,8, 3-49,6, 4-74,0. Концентрации: пероксидаза — 0,26 нМ; перекись водорода — 0,64 мМ; рН 5,5, 0,1 М натрий-ацетат. ляемым (кверцетин), а другой быстро окисляемым (о-дианизидин) (схема 7). схема 7 Е+РЩ—Ь-*Е, К, E1-S1-^E2-F-^E+P1 1 * [s3r E.+ „ „ 53-E,-S, -^S3-E1-F-^E-S3 + P1 ?IS?~E'" E, —S3 ^E+R, S3 — кверцетин; E, — S3 — комплекс кверцетина с E,; S3 - E, — S,, S3 — E, — P- — комплексы о-дианизидина и полуокисленного о-дианизидина с Е, и кверцетином. Наблюдаемый эффект является следствием того, что кверцетин является медленно окисляемым субстратом пероксидазы скорость окисления которого в присутствии быстро окисляемого субстрата возрастает, что и создает конкуренцию. 81 Глава 111 Установлено, что при совместном присутствии в реакционной среде АК и о-дианизидина отмечается их дифференцированное пероксидазное окисление при котором окисление о-дианизидина не происходило до полного превращения аскорбиновой кислоты. Причем АК окисляется полуокисленным промежуточным фермент-субстратным комплексом пероксидазы аналогично ферроцианиду. На основании полученных данных совместное пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты и о-дианизидина можно описать следующей схемой 8. схема 8 E1+S)-^E1-S1^->E2-F-A->E+P1 K71TS4 [E,-SJ+P4 S4 — аскорбиновая кислота. Скорость пероксидазного окис |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 |
Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |