еских закономерностей пероксидазного окисления люминола и пирогаллола в стационарных условиях [Dure, Cormier, 1963; 1964].

В каталитическом процессе пероксидазного окисления одной и более молекул АК принимают участие ионогенные группы фермента с рК~6,0 и 6,5 (рис. 10). Протонирование этих функциональных групп активного центра пероксидазы ускоряет каталитический процесс.

Для объяснения активации пероксидазного окисления АК и ингибирования фермента высокими концентрациями субстрата предложена схема 1 ферментативной реакции:

схема 1

E,+AH2<=^E,

-АН2—^->Е2-АН—^_»Е+А

U АН,

AHj-Ej-AH—**->Е+2А

U пАН2 Е2-(п + 2)АН2 56

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Е, Е,, Е2 — исходный фермент и его промежуточные соединения 1 и 2, соответственно, АН2 — аскорбиновая кислота, Е, — АН2, Е2 — АН-, АН- — Ej — АН2, Е2 — (п + 2)АН2 — комплексы одной, двух и (п + 2) молекул аскорбиновой кислоты с промежуточными соединениями Е, и Е2, к,, Ц, к3 и к. — каталитические константы.

4

Схема 1 предполагает, что пероксидазное окисление АК осуществляется, если с окисленными формами фермента (Е, и Е2) связываются одна или две молекулы АК. При этом связывание молекулы субстрата в одном из участков активного центра пероксидазы инициирует каталитический процесс, тогда как занятость сразу двух участков субстратами проявляется в активировании фермента. Однако ингибирующее действие субстрата реализуется при связывании нескольких (6—7) молекул АК в области активного центра или в месте расположения регуляторного участка.

3.2. КИНЕТИКА СОВМЕСТНОГО ОКИСЛЕНИЯ ДВУХ МЕДЛЕННО ОКИСЛЯЕМЫХ СУБСТРАТОВ ПЕРОКСИДАЗЫ (АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА И ФЕРРОЦИАНИД КАЛИЯ)

Кинетика пероксидазного окисления ферроцианида калия была изучена ранее [Лебедева и др., 1981]. Показано, что при рН 5—7 Кт составляет 0,2—0,4 мМ, в то время как величина kcat уменьшается с увеличением рН от 300 до 60 сек-1. Предложена схема 2 пероксидазного окисления ферроцианида в стационарных условиях [Угарова и др., 1981].

схема 2 E+HA—Ь-^Е,

E1 + S1?i|i±E1-S1-S->E2 + P1

E2+S1<=±E2-S1—^->Е +Р,

Е, Е,, Е2 — нативный фермент и его окисленные формы; S, — ферроциа-нид, Е, —S,, Е2—S, — комплексы окисленных форм фермента с ферроци-анидом.

Однако характер взаимодействия ферроцианида с ферментом пока недостаточно ясен. Невыясненным является и вопрос об об-

57

Глава III

ласти активного центра пероксидазы для неорганических субстратов [Лебедева, Угарова,. 1996]. Изучена стационарная кинетика совместного окисления ферроцианида калия и о-дианизи-дина [Ugarova et al, 1981]. Показано, что при совместном присутствии в реакционной среде ферроцианид и о-дианизидин окисляются при наличии перекиси водорода и пероксидазы дифференцированно. Окисление о-дианизидина не наблюдается до полного превращения ферроцианида. о-Дианизидин связывается в пероксидазе только с ее белковой частью. Образовавшийся радикал может не выходить в раствор, а оставаться на ферменте, образуя фермент-субстратный комплекс, который ускоряет окисление ферроцианида в 10—20 раз. Предложена схема 3 совместного окисления ферроцианида и о-дианизидина [Лебедева, Угарова, 1996].

схема 3 Е+НД,—Ь-»Е,

Е, + S2 +^=± Е, - S2 —Ь_» Е2 - S2 ¦ —Ь_> Е+Р2 [S,]ik'4 E,-S2+P,

Е, — S2 — комплекс о-дианизидина (S2) с Е,, Е2 — S2 — комплекс Е2 с полуокисленным о-дианизидином, Р, и Р2 — продукты индивидуального окисления ферроцианида и о-дианизидина соответственно.

В литературе имеется множество примеров субстрат-субстратной активации, т.е. ускорения окисления медленно окисляемого субстрата быстро окисляемым [Угарова и др., 1981]. При одновременном присутствии в растворе различных субстратов пероксидазы наблюдаются эффекты взаимной активации и ингибирования. При этом ингибирование либо имеет конкурентный характер, либо связано с дифференцированным окислением субстратов в присутствии пероксидазы [Лебедева, Угарова, 1996]. Однако практически отсутствуют сведения по стационарной кинетике совместного окисления двух медленно окисляемых субстратов, к которым относятся ферроцианид калия и аскорбиновая кислота. К тому же в ряде работ приводятся противоречивые данные о механизме катализируемого пероксидазой окисления ферроцианида калия [Савицкий, 1979; Угарова и др., 1981; Лебе-

58

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

дева, Угарова, 1996]. Его относят к группе субстратов, для которых возможен непосредственный контакт с гемом фермента [Савицкий, 1979]. Хотя известно, что при значениях рН близких к нейтральным гемин в пероксидазе недоступен даже малым ионам из раствора [Угарова и др., 1981]. Высказываются предположения, что широкую субстратную специфичность пероксидазы можно объяснить в рамках представления о ферменте как белке-проводнике, имеющем несколько различных каналов электронного транспорта с субстратов, контактирующих с поверхностью его белковой глобулы, на железо гема. Некоторые из этих каналов транспорта электронов могут включать и порфириновый макроцикл [Лебедева, Угарова, 1996].

Имея разные участки связывания, молекулы АК могут осуществлять регулирование каталитического процесса. Однако оставался не решенным вопрос о взаимном регулировании каталитического процесса при окислении двух медленно окисляемых субстратов. Поэтому изучение совместного перксидазного окисления ферроцианида и аскорбиновой кислоты позволило определить участки связывания этих двух медленно окисляемых субстратов на поверхности белковой глобулы фермента и объяснить механизмы их окисления [Рогожин, Верхотуров, 19996].

Показано, что при совместном окислении ферроцианида и аскорбиновой кислоты наблюдалось ускорение пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты (рис. 11), проявляемое в смешанном типе активации, при котором предварительное связывание ферроцианида облегчало последующее связывание АК, ускоряя ее окисление (рис. 12). Однако конкуренция между субстратами проявлялась еще и в том, что аскорбиновая кислота понижала скорость пероксидазного окисления ферроцианида, ингибируя фермент по смешанному типу, оказывая влияние как на связывание, так и превращение ФК (табл. 6). Характер ингибирования позволяет предположить, что участки связывания АК и ФК в активном центре пероксидазы пространственно удалены. При этом предварительное связывание одной молекулы АК в активном центре фермента затрудняло последующее связывание молекул ферроцианида. Однако связывание с ферментом двух молекул АК полностью блокировало реакции окисления ферроцианида.

Для объяснения кинетики совместного окисления ферроцианида калия и аскорбиновой кислоты предложена схема 4.

59

Глава III

1/v 10"", мин M"1

1/АК 10~4, М~'

Рис. II. Зависимости начальных скоростей пероксидазного окисления АК от ее концентрации в координатах Лайну-ивера-Берка в присутствии (1) и в отсутствие (2) ферроцианида калия. Концентрации: пероксидазы — 0,2 мкМ, Н202 - 0,64 мМ, АК - 20-240 мкМ, ФР — 88 мкМ, рН — 7,0. Регистрация при 265 нм.

Рис. 12. Зависимости обратных начальных скоростей пероксида