Биологический каталог




Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов

Автор В.В.Рогожин

тивности в различных биологических образцах и в иммуноферментном анализе [Гончар, Сибир-ный, 1988]. Таким образом, активное использование пероксидазы в аналитических исследованиях обуславливает интерес к изучению механизма действия фермента в реакциях индивидуального и совместного окисления субстратов. Использование последних в аналитических исследованиях может способствовать разработке высокочувствительных методов анализа.

ГЛАВА III

ПЕРОКСИДАЗА В РЕАКЦИЯХ ОКИСЛЕНИЯ МЕДЛЕННО И БЫСТРО ОКИСЛЯЕМЫХ СУБСТРАТОВ

Пероксидаза катализирует окисление неорганических и органических соединений в присутствии перекиси водорода. По скорости окисления их можно условно разделить на быстро окисляемые (о-дианизидин, гидрохинон, р-крезол и т.д.) и медленно окисляемые (аскорбиновая кислота, NADH, люминол, ферроци-анид и т.д.). Предложено [Угарова и др., 1981; Кутузова, 1981], что взаимодействие субстратов-восстановителей с промежуточными окисленными формами фермента может осуществляться при участии боковых функциональных групп белка. Методом химической модификации в пероксидазе обнаружена функционально важная имидазольная группа гистидина [Welinder, 1979; Welinder et al, 1972]. Многие другие остатки гистидина, триптофана, тирозина и т.д. маскированы внутри белковой глобулы [Савицкий, 1979; Кутузова, Угарова, 1981]. Однако участие пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного окисления субстратов и особенности протекания этих реакций были недостаточно изучены. Не было представлено убедительных доказательств, объясняющих отсутствие специфичности в действии фермента при протекании индивидуальных реакций окисления и проявление специфичности пероксидазы в реакциях совместного окисления. Все эти и другие вопросы побудили нас провести детальное исследование поведения пероксидазы в реакциях индивидуального и совместного окисления, используя различные комбинации субстратов в реакционной среде. В качестве медленно окисляемых субстратов пероксидазы были выбраны ферроцианид и аскорбиновая кислота, а быстро окисляемыми — гидрохинон и о-дианизидин.

3.1. КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Механизмы действия пероксидазы в реакциях индивидуального окисления были изучены на примере окисления аскорбиновой кислоты, которая в растительных и животных клетках уча-

53

Глава III

ствует в окислительно-восстановительных реакциях, выполняет роль антиоксиданта и выступает в качестве гидроксилирующего агента при образовании кортикостероидов в надпочечниках [Гуд-вин, Мерсер, 1986; Кения, Лукаш и др., 1993; Buettner, Moseley, 1992; Mapson, 1967].

Аскорбиновая кислота может накапливаться в различных растительных клетках и тканях, а также в хлоропластах [Foyer et al., 1983], в митохондриях [Чупахина и др., 1987], в околоядерной зоне и внешнем слое цитоплазмы растительной клетки [Jensem, Kavaljian, 1956]. В клетках корня хрена вся АК сосредоточена в больших центральных вакуолях [Grob, Matile, 1980].

Методом остановленной струи измерены константы скорости реакции (к2 и к3) взаимодействия Е, и Е2 с аскорбиновой кислотой [Smith, Williama, 1970]. Показано, что Ц имеет значение 2,3 • 10* М-1-с1, а к3 — 2,6 ¦ 104 М-|-с~'. Следовательно, для пероксидазного окисления АК величины к3 примерно в 100 раз меньше, чем Ц. Причем величины констант к, и к3 соизмеримы с величинами аналогичных констант, определенных для реакций пероксидазного окисления ферроцианида калия [Hasinoff, Dunford, 1970] и люминола [Prichard, Cormier, 1968; Пучкаев, Метелица, 1993].

Кинетические закономерности пероксидазного окисления АК в стационарных условиях практически не исследованы. Предложен калориметрический метод определения пероксидазного окисления АК. Обнаружено изменение стехиометрии реакции между АК и пероксидом водорода в зависимости от условий протекания пероксидазного процесса. Показано, что АК в пероксидазном процессе окисляется пероксидом водорода в стехиометрическом соотношении 1:1 при рН 5,0 и 1:2 при рН 7,4. Отмечено, что при рН 7,4 кинетика утилизации Н202 при пероксидазном окислении АК имеет аномальный по сравнению с другими субстратами характер, что связано, по-видимому, с модификацией фермента в процессе реакции [Титов и др., 1992]. Однако более подробного исследования кинетических особенностей реакции не проводилось. Поэтому нами изучена кинетика реакций пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, катализируемое пероксидазой хрена [Рогожин, Верхотуров, 1997].

Показано, что при окислении аскорбиновой кислоты, в действии пероксидазы реализуется сложный регуляторный механизм.

54

Пероксидаза в реакциях окисления медленно и быстро окисляемых субстратов

Таблица 5

Величины каталитических констант пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты

рН К^мкМ ка1,сек"' к'^.сек-' Р п

4,0 420 + 34 24,7 + 2,1 8

4,5 380 + 28 20,2 + 2,0

5,0 9,7 + 0,4 340 + 31 2,1+0,12 17,6+ 1,5 18,6+1,4 8

5,5 10,8 + 0,5 170+ 12 1,9±0,11 6,8 ±0,3 4,5 ±0,3 7

6,0 6,1 ±0,3 190 ±10 1,1±0,11 8,4 ±0,9 12,4 ±0,9 6

6,5 150+13 4,0 + 0,2

7,0 11,5 ±0,4 230 ±18 1.1 ±0,10 3,7 + 0,1 7,5 + 0,5 9

8.0 97±7 3,8 + 0,1 9

Установлено, что по величине kcat равной 1,1—2,1 с-1, АК можно отнести к группе медленно окисляемых субстратов пероксидазы (табл. 5). При этом константа связывания АК с окисленными формами пероксидазы соизмерима с Кт быстро окисляемых органических субстратов фермента (Кт1 составляет 9,7—11,5 мкМ, а Кт2 — 97—420 мкМ), поэтому предварительное связывание АК с

V, мкМ мин 1

6

15 20 25

1/АК КГ4, М-1 Рис. 8. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты от ее концентрации в координатах Л айнуивера-Берка. рН 5,0— 1, 5,5 — 2,6,0— 3; пероксидаза — 0,1 мкМ; перекись водорода — 0,64 мМ; аскорбиновая кислота - 2,2-220,0 мкМ.

0

-6

-4

lg[AK]

Рис. 9. Ингибирование реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты ее избытком. рН 5,5; 0,1 М Na-ацетатный буфер; пероксидаза— 0,1 мкМ; перекись водорода — 0,64 мМ; аскорбиновая кислота— 22,0-352,0 мкМ.

55

Глава III

1,5

0,5-

0

-0,5

3,5 4,5 5,5 6.5 7,5 8,5 РН

Рис. 10. Зависимость lgkcal (1) и lg k^t (2) пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты от рН.

Е, и Е2 может препятствовать их пе-роксидазному окислению. При связывании двух молекул АК процесс пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты ускорялся (рис. 8), а избыток АК способствовал понижению каталитической активности фермента (рис. 9). Активирование пероксидазы, по-видимому, обусловлено связыванием в активном центре фермента двух и более молекул субстрата, что позволяет предположить наличие протяженной субстратсвя-зывающей области на поверхности белковой глобулы, состоящей из нескольких участков, реализующих механизм последовательного связывания молекул субстрата [Рогожин, 1996].

Аналогичное предположение образования тройного промежуточного комплекса Е2 с двумя молекулами донора водорода было высказано для объяснения кинетич

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Скачать книгу "Пероксидаза как компонент антиоксидантной системы живых организмов" (3.56Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.08.2019)