анизма. Современные физико-химические, биохимические, физиологические и иитоморфологические методы позволяют с большой точностью изучать биохимические процессы на молекулярном, субклеточном, клеточном уровнях. Поэтому следует обратить особое внимание на разработку и усовершенствование методов, которые позволили бы значительно расширить возможности более углубленного изучения биохимических процессов как в целом головном мозгу, так и в его отделах, областях и т. д.

1.3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

За последние 30 лет в биохимических исследованиях произошли коренные изменения, вызванные исключительно широким использованием новейших химических, физических, фнзико-химвдеских.и разнообразных биохимических методов исследования. В этот же период были усовершенствованы физиологические методы и прежде всего_м_икроэлектродная техника, в результате чего физиологи получили возможность проводить исследования на клеточном и субклеточном уровнях. Применение электронной-микроскопии и цитохимических методов позволило морфологам совместно с биохимиками и физиологами комплексно подойти к разработке ряда кардинальных вопросов, таких как структура и функции субклеточных образовании, проведение нервного импульса и т. д. При этом следует отметить, что за последние два-три десятилетия были разработаны и усовершенствованы такие химические и физические методы, как спектроскопия (в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях), флуореметрия и другие, благодаря которым

и

чувствительность и точность количественного определения в биологических субстратах возросли в 104—106 раз. С помощью современных методов исследования стало возможным определять вещества, содержащиеся в биологических системах, в том числе и в нервной ткани, в пределах 0,1—0,001 мкг.

Животные ткани, особенно нервная ткань, характеризуются большим разнообразием метаболитов, участвующих в биохимических процессах. Многие из них играют чрезвычайно важную роль в обменных процессах нервной ткани, хотя они содержатся в ничтожных количествах. Например, глюкоза является не только основным энергетическим источником, но и важнейшим предшественником разнообразных метаболитов (аминокислот, жирных кислот и т. д.) в головном мозгу. В то же время ее содержание в нервной ткани животных и человека находится в пределах 1,0—2,0 мкмоль/г. Пировиноградная кислота, играющая исключительно большую роль в ряде биохимических процессов гйловного мозга, составляет только 0,15 мкмоль/г. Лимонная кислота, являющаяся, как известно, важнейшим компонентом аэробного окисления углеводов, липидов и аминокислот, содержится в головном мозгу в количестве 0,25—0,30 мкмоль/г. Суммарное содержание свободных жирных кислот в мозговой ткани составляет не более 1—2 мкмольт. Незначительное количество приходится также на долю специфических липидов — ганглиозидов, дифосфоинозитидов и трифосфоино-зитидов, участвующих непосредственно в функционировании нервной системы. При расчете на 1 г мозга ганглиозиды содержатся в количестве 1,50 мг, дифосфоинозитиды — 0,60 и три-фосфоинозитиды — 0,36 мг. Если сравнить их содержание с общим количеством липидов в 1 г мозговой ткани, то ганглиозиды будут составлять 1,5%, дифосфоинозитиды — 0,6 и трифосфо-инозитиды — 0,36%. Еще в меньших количествах содержатся в мозговой ткани гормоны, нейромедиаторы, нейропептиды, их количество, как правило, находится в пределах сотых, тысячных и даже десятитысячных долей микромолей на 1 г ткани. Например, содержание адреналина в мозгу не превышает 0,0005—0,001 мкмоль/г. Это в значительной мере длительное время затрудняло изучение обменных процессов в нервной ткани. В настоящее время усовершенствование оптических и других методов привело к тому, что стало возможным определять 1 мкг (10~6 г) и даже 1 нг (10~9 г) вещества, а также обнаруживать незначительные изменения в их содержании при различных функциональных состояниях животного организма.

Благодаря интенсивной разработке и широкому применению различных методов хроматографии—бумажной, ионообменной, адсорбционной, газожидкостной (газовой) и тонкослойной — появилась возможность разделять и выделять индивидуальные вещества из животных тканей, в том числе из головного мозга. Например, для разделения с помощью газовой и тонкослойной

12

хроматографии требуются миллиграммы и даже микрограммы изучаемых веществ, т. е. в миллионы (106) раз меньше, чем было необходимо при использовании методов осаждения и высаливания для препаративных целей. Кроме того, газовая и тонкослойная хроматографии характеризуются быстротой разделения и точностью количественного определения изучаемых соединений. Так, например, с помощью газовой хроматографии были определены количественно все жирные кислоты, находящиеся в различных отделах головного мозга. Подобные определения не могли быть выполнены другими методами.

Следует также особо отметить, что, несмотря на высокую интенсивность обменных процессов, количественное содержание многих физиологически важных веществ в головном мозгу существенно не изменяется даже при различных функциональных состояниях организма. На основании этого делались неправильные выводы о том, что те вещества, содержание которых не изменяется при различных воздействиях, являются инертными соединениями. Только благодаря применению метода меченых (радиоактивных) атомов удалось проникнуть в интимные механизмы и установить участие ряда веществ в обменных процессах, происходящих в головном мозгу. Особенность метода радиоактивной индикации состоит в том, что исследования проводятся в условиях, наиболее близких к тем, которые существуют в органах и тканях целостного организма. Это объясняется тем, что при изучении обменных процессов с помощью радиоактивных веществ, которые вводятся в ничтожных количествах, не происходит изменения нормального хода биохимических превращений.

Покажем это на конкретном примере. В своих опытах мы использовали меченые источники — глюкозу, ацетат, аминокислоты и другие, содержащие радиоактивный углерод 14С. Меченую глюкозу, ацетат, аминокислоты вводили в количестве от 5 до 20 мккюри на 100 г веса животного, причем такого количества было достаточно для одновременного изучения самых разнообразных биохимических процессов, происходящих как в головном мозгу, так и в других органах и тканях животного. Чтобы выяснить, в какой степени происходит разбавление радиоактивного углерода 14С нерадиоактивным 12С при введении от 0,05 до 0,2 мккюри на 1 г веса животного, мы произвели соответствующий расчет, используя период полураспада МС, равный 5582 годам. Следовательно, при введении 0,05 мккюри в минуту на 1 г ткани будет распадаться 0,75 нг МС, а при введении 0,20 мккюри эта величина будет соответствовать 3,0 нг 14С. Количество нерадиоактивного углерода, содержащегося в 1 г ткани, в среднем принимали равным 150 мг, т. е. 1,5-10* нг.

Пример расчета. 1. Определение числа импульсов в минуту, приходящихся на 1 г углерода ИС:

13

Здесь Л — число Авогадро; а — атомный вес НС; Т — период полураспада 14С, мин (5582 • 365 • 24 • 60 =