Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

щих Т-лимфоцитов

Впервые успешное слияние функциональных Т-лимфоцитов и Т-клеточной тимомы осуществили Танигучи и Миллер в 1978 г. [7]. Эти авторы использовали преимущества двух процедур отбора, что повысило вероятность получения ими супрессорной Т-клеточной гибридомы. Сначала они отбирали антигенсвя-зывающие клетки селезенки мышей с индуцированной ранее толерантностью к человеческому гамма-глобулину (ЧГГ) на чашках, покрытых ЧГГ. Затем с помощью лазерного сортировщика клеток они отобрали те гибридные клетки, которые окрашиваются антителами против продуктов субобласти /-/ главного комплекса гистосовместимости (МНС) мыши. В последующих экспериментах по Т-Т-гибридизации эти подходы использовались во многих лабораториях.

При работе с Т-клеточными гибридомами основная трудность связана с их функциональной нестабильностью, которая многократно отмечалась наиболее

30.

Длительные культуры

иммунокомпетентных клеток опытными исследователями. Эту нестабильность объясняют потерей хромосом. Для сохранения функциональной активности можно реклонировать клетки, хотя это и трудоемкое дело. Все это накладывает ограничения на работу с Т-клеточными гибридомами и в настоящее время служит камнем преткновения для многих исследователей.

Метод, описанный в предыдущих разделах, позволил ряду исследователей из нескольких лабораторий независимо выделить и поддерживать долгосрочные культуры иммунокомпетентных Т-лимфоцитов. Главный недостаток этих методов связан с необходимостью постоянной рестнмуляции и тщательной проверки характеристик культуры для поддержания «нормальных» Т-клеточных линий в течение длительного периода. Для того, чтобы преодолеть трудности, связанные с длительным культивированием клонов Т-лимфоцитов, некоторые исследователи обратились к технике слияния соматических клеток, которая рассматривалась ранее в гл. 28 в связи с получением гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. Метод слияния Т-лимфоцитов с линией клеток тимомы, несущей метаболический маркер устойчивости к 6-тиогуанину, подобен изящной процедуре, которую впервые использовали Кёлер и Милынтейн [781] для слияния В-лимфоцитов с миеломной линией клеток, несущей метаболический маркер устойчивости к 8-азагуанину. Детальное описание метода Т-Т-гибриди-зации можно найти в других работах [8, 9].

Для получения Т-клеточных гибридомных клеток примерно 108 активированных антигеном Т-лимфоцитов (с супрессорной или хелперной функцией) и 107 клеток BW 5147 (лишенной гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфе-разы линии тимомы мышей AKR, полученной доктором Р. Химэном) дважды отмывают бессывороточным сбалансированным солевым раствором (СбСР) Хэнкса. Затем клетки центрифугируют при 400 g, надосадочную жидкость уда-- ляют и к осадку в течение 2 мин добавляют по каплям 0,5 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ, мол. масса 1500) в СбСР, рН 7,8. При этом клетки мяг-" ко перемешивают. Затем так же, по каплям, к клеткам добавляют 0,5 мл бессывороточного СбСР, потом еще 5 мл и, наконец, объем пробирки с клетками доводят СбСР до 20 мл. Клетки центрифугируют при 400 g, надосадочную жидкость удаляют, клеточный осадок ресуспендируют в 100 мл МДСИ с 20% ЭТС и по 2 мл клеточной суспензии рассевают в каждую лунку 48-луночных пластин (Linbro). Приблизительно через 24 ч после слияния из лунок отбирают по 1 мл МДСИ с 20% ЭТС и добавляют 1 мл среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ) (МДСИ, 20% ЭТС, 1,1-10-* М гипоксантина, 1,6-10"8 М тимидина и 4-10~7М аминоптерина). В течение следующих двух дней эту процедуру повторяют. На 6-, 8- и 10-й день вместо ГАТ-среды добавляют ГТ-среду (МДСИ, 20% ЭТС, 1,1-10-* М гипоксантина и 1,6-10-5М тимидина). Затем, начиная с 12—13-го дня, клетки постепенно переводят на МДСИ с 10% ЭТС, заменяя каждые три дня по 1 мл надосадочной жидкости на 1 мл свежей МДСИ с 10% ЭТС. Клетки из лунок, в которых через 1—3 недели после рассева отмечается рост, можно рассеять в другие лунки и перенести в маленькие культуральные флаконы. В отобранных пробах надосадочной жидкости можно затем исследовать функциональную активность, характеризующую исходные Т-лимфоциты, участвовавшие в слиянии с BW5147.

Такие линии Т-клеточных гибридом легко поддерживаются простой подкормкой через каждые три дня при условии, что максимальная плотность не будет превышать 1 • 106 клеток на 1 мл среды. Эти клетки можно замораживать и хранить неограниченно долгое время в жидком азоте. Клетки надо замораживать следующим образом: клетки центрифугируют при 170 g в течение 10 мин при 4 °С и осадок ресуспендируют в 1 мл среды для замораживания (МДСИ, С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч

20% ЭТС, 10% ДМСО). Все манипуляции с клетками в среде для замораживания проводят на льду (4°С). Клетки замораживают в пластиковых ампулах, которые помещают в коробки из пенопласта и оставляют на ночь в низкотемпературном холодильнике при —70 °С. В этих условиях замораживание происходит со скоростью примерно 1 °С/мин. На следующий день клетки можно перенести в жидкий азот. При размораживании клетки оттаивают в водяной бане при 37 °С. С исчезновением последнего кристаллика льда клеточйую суспензию разводят в 10 раз добавлением холодной МДСИ (4 °С), содержащей 20% ЭТС. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 15 мл МДСИ с 10% ЭТС и переводят в культуру.

С помощью техники слияния BW5147 с иммунными Т-лимфоцитами различного происхождения были получены гибридные клетки, секретирующие практически все биологически активные лимфокины. Особый интерес представляет большая группа данных, свидетельствующая об успешном использовании этой технологии для получения антиген-специфических супрессорных Т-клеточных гибридом [8, 9, 79—84], цитотоксических гибридом [85, 86,], гибридом, секретирующих лимфокины, одного или более типов, и гибридом с функцией хелперных Т-лимфоцитов [87 , 88]. Преимущество этой техники перед получением и культивированием клонированных Т-лимфоцитов связано с относительной простотой наработки большого количества клеток и (или) биологически активных продуктов таких клеток.

Одну из наиболее изученных систем антиген-специфических факторов супрессорных Т-клеток, полученных с помощью слияния антиген-специфических Т-супрессоров и тимомы, описали Кэпп и др. [84]. Эти авторы получили свои гибридомы при слиянии тимомы В W 5147 и Т-клеток селезенки мышей DBA/1, которых иммунизировали полипептидом (глутаминовая кислота, аланин, тирозин) (ГАТ). Гибридомы отбирали, определяя в биологическом эксперименте конститутивный синтез ГАТ-специфического Т-супрессорного фактора. С помощью такого подхода авторам удалось выделить несколько гибридом с конститутивной секрецией антиген-специфических супрессорных факторов. Недавно они описали моноклональный супрессорный фактор Т-клеточного происхождения, продуцируемый Т-гибридомой 258.С4.4; этот фактор очищен до гомогенности [89].

Другой пример изящного использования технологии Т-клеточной гибридизации представляют исследования Кэпплера и др. [9]. Эти исследователи использовали Т-клеточные гибридомы для изучения свойств «неуловимого» антиген-специфического рецептора Т-лимфоцитов х. Они создавали гибридомы для получения клонированных клеток, одновременно экспрессирующих две разные антигенные специфичности и две разные рестрикционные детерминанты I-района. Это позволило авторам проверить две основные теории, касающиеся одновременно распознавания антигена и продуктов области /. Теории «двух рецепторов», обсуждавшиеся ранее (гл. 11), постулируют наличие рецепторов, независимо распознающих на клеточной поверхности антиген и продукты области /. Из этого следует, что слившаяся клетка, которая унаследовала две различные антигенные специфичности и две I-рестрикционные специфичности, должна распознавать любые комбинации двух антигенов и двух рестриктирую-щих элементов. Теории «одного рецептора», в отличие от этого, предсказывают,

1 В настоящее время структурная и генетическая организация Т-клеточного рецептора уже установлена в результате работ ряда авторов (см. примеч. на стр. 35), в том числе дальнейших исследований данной экспериментальной системы.— Прим. перев.

30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток что гибрид, полученный в результате такого слияния, не будет распознавать смешанные комбинации антигенов и продуктов области /. Полученные авторами результаты свидетельствуют против теории «двух рецепторов» в ее строгой интерпретации, поскольку при слияниях не было обнаружено гибридом, распознающих «смешанные» пары антиген—молекула 1а.

30.10. Длительное культивирование и клонирование

В-лимфоцитов

В предыдущих разделах этой главы подробно рассмотрены выделение, наращивание и характеристика клонов Т-лимфоцитов. Позднее были предприняты попытки клонировать В-лимфоциты и поддерживать их в длительных культурах. Длительно культивируемые нетрансформированные В-лимфоциты нужны не для изучения основного продукта плазматических клеток, иммуноглобулинов, а для анализа клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих активацию, пролиферацию, дифференцировку и индукцию толерантности у нормальных В-лимфоцитов. В литературе появилось несколько сообщений об успешном получении колоний мышиных и человеческих В-лимфоцитов в мягком агаре при использовании для стимуляции клеток митогенов или Т-клеточных факторов. Лишь в самое последнее время исследователям удалось нарастить и клонировать потомство колоний человеческих В-лимфоцитов; мышиные В-клетки не удалось размножить из В-клеточных колоний. Длительное поддержание в культуре нетрансформированных вирусом Эпштейна— Барр В-лимфоцитов из отдельных колоний остается до сих пор сложной процедурой и критические условия для поддержания роста клеток до конца не установлены. Для детального знакомства с этой проблемой читателю следует обратиться к работе Средни и др. [90].

Альтернативный подход к получению В-клеточных линий заключается в культивировании суммарной популяции В-лимфоцитов в течение длительного времени [91]. Некоторый успех был достигнут при культивировании высоко очищенных мыш

страница 99
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.04.2017)